分子影像和體外分子診斷是最有望實現(xiàn)腫瘤早期微、無創(chuàng)檢測的兩大技術(shù)。與經(jīng)典影像不同,分子影像例如熒光分子成像,能夠探查腫瘤早期形成過程中細胞和分子水平的異常,即在尚無解剖學改變之前就能檢查出異常,這對腫瘤早期檢測有重要價值。然而分子影像學技術(shù)的發(fā)展還處于臨床前實驗階段,大多分子探針的靶向性或特異性還有待提高。另一方面,循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）因含有豐富的腫瘤相關(guān)遺傳信息或突變信息成為體外分子診斷研究熱點之一。借助PCR技術(shù)和DNA雜交技術(shù),一些ctDNA檢測試劑已經(jīng)用于臨床腫瘤疾病的輔助診斷。由于ctDNA在標本中的含量非常少,并且豐度較低的腫瘤突變基因中往往伴隨著大量的野生型基因,這對ctDNA檢測技術(shù)的靈敏度有很高的要求�，F(xiàn)有的ctDNA檢測技術(shù)的靈敏度有限,檢測相應的低豐度突變（<1%）ctDNA的腫瘤標本時會出現(xiàn)漏檢的情況。無論是分子影像還是體外分子診斷都需要發(fā)展高特異性、高靈敏度的分子探針。本研究聚焦于分子影像和體外分子診斷領(lǐng)域在臨床應用中共同存在的問題并以此為出發(fā)點,探究提高DNA鏈置換探針特異性的方法及其用于改善分子影像技術(shù)和分子診斷技術(shù)性能的可行性,具體研究內(nèi)容... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

Au-TDNNs的結(jié)構(gòu)及其檢測活細胞內(nèi)miRNA-21的工作原理

31TDNNs.3.2設計雙鏈檢測探針在檢測探針的設計過程中，根據(jù)miRNA-21的過表達水平和生物學意義，本實驗選擇miRNA-21作為檢測靶標[165,188]。在達到近似熱力學平衡（ΔG0≈0）的條件下，期望探針Exp可與靶標自發(fā)雜交[148]。為了比較ExP的特異性，實驗設計了普通檢測探針（OrP）作為ExP的對照探針。OrP2與靶標雜交產(chǎn)物的吉布斯自由能變小于OrP2與OrP1雜交的吉布斯自由能變（表2.4）。標準吉布斯自由能可以用ΔG0=-RTln（Keq）計算，其中T表示凱氏溫度，R表示氣體常數(shù)，Keq表示平衡常數(shù)。在7nt立足點（Toehold）的條件下，鏈置換反應的速率常數(shù)為1×106M-1s-1[146]。本文使用專業(yè)軟件UNAfold（http://mfold.rna.albany.edu/）模擬雙鏈核酸的熱力學參數(shù)，表2.4總結(jié)了實驗中雙鏈核酸的熱力學參數(shù)。圖2.1為ExP和OrP在檢測miRNA-21過程中識別單堿基突變靶標和野生型靶標的工作原理。本實驗新設計了TDN的寡核苷酸序列，以避免與檢測探針發(fā)生非特異性雜交，所有寡核苷酸序列均在表2.2中提供。圖2.1ExP（A）和OrP（B）用于識別單堿基突變靶標和野生型靶標的工作原理。Tehold介導的鏈置換探針（例如ExP1P2）由補體鏈ExP2和保護鏈ExP1雜交組成，它們可以與靶標反應產(chǎn)生ExP1和TExP2。

33圖2.2（A，B）分別使用ExP和OrP檢測中間，遠端，近端單堿基突變靶標和野生型miRNA-21靶標的熒光動力學曲線。（C）在檢測單堿基突變靶標和野生型miRNA-21靶標時，ExP和OrP的熒光強度增量。（D）ExP和OrP的相應識別因子（DF）。（E）紫外-可見光吸收光譜表征Au-TDNNs在SSC，PBS和DMEM（10％FBS）中的穩(wěn)定性。（F）Au-TDNN逐步組裝產(chǎn)物的Zeta電位分析。RFI：相對熒光強度。DF=ΔFtarget/ΔFtargetanalogue（ΔF=F-F0，F(xiàn)0：背景熒光）。*P＜0.001。Fig.2.2(A,B)Fluorescencekineticcurvesofmutationbaseinthemiddle,distalorproximalsiteofthetargetandtargetdetectionbyExPandOrP,respectively.(C)Relativefluorescence


本文編號：3442012