本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒的病毒樣顆粒疫苗制備及其感染導(dǎo)致肺損傷機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是全球新生兒與老年人最為常見的呼吸道疾病病原之一。70%以上的RSV患兒是5歲以下的兒童,其中10%因下呼吸道感染(LRTI)而入院治療。自上世紀(jì)60年代,全球科學(xué)家不遺余力地研制RSV疫苗,遺憾的是市場上至今沒有認(rèn)證的預(yù)防疫苗。由此,WHO要求世界各國做好防控RSV的工作。1956年,Blount課題組首次發(fā)現(xiàn)黑猩猩鼻炎分泌物(CCA)的合胞病毒。第二年,Chanock等人報(bào)道CCA可感染嬰幼兒及兒童引發(fā)支氣管炎,并將CCA分離,發(fā)現(xiàn)其感染細(xì)胞后出現(xiàn)大片融合現(xiàn)象,因此命名為呼吸道合胞病毒(RSV),屬于副黏病毒科RNA病毒。其基因組大小為15kb,編碼11個(gè)蛋白。其中表面糖蛋白F、G為主要保護(hù)性抗原,包括絕大部分中和抗體表位及T細(xì)胞抗原決定簇。保守性F蛋白主要誘導(dǎo)CTL,促進(jìn)CD4+與CD81細(xì)胞應(yīng)答,活化Thl免疫應(yīng)答。特異性G蛋白可誘導(dǎo)Th2偏向性免疫應(yīng)答,依據(jù)G蛋白將RSV分為A和B群兩個(gè)血清亞型。臨床上,RSV呈現(xiàn)交替的優(yōu)勢流行。早在上世紀(jì)70年代,采用甲醛滅活研制的FI-RSV疫苗不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)。且80%受試患嬰出現(xiàn)免疫增強(qiáng)性疾病(VED)入院治療,甚至導(dǎo)致2名患兒嬰死亡而終止臨床研究。隨后采用傳代培養(yǎng)、臨床分離、基因改造方法研制的RSV減毒活疫苗,具備良好的免疫原性及保護(hù)性,其潛在的病毒安全性備受爭議而止步于二期臨床研究。接著采用基因重組制備的F、G蛋白亞單位疫苗,如BBG2Na進(jìn)入三期臨床試驗(yàn),因保護(hù)不全面停止后續(xù)研究。另外,采用HPIV、ADV為載體研制的重組載體疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究,因載體病毒具有預(yù)存免疫應(yīng)答(pre-exsiting immunology, PEI)終止試驗(yàn)。由此可見,RSV疫苗研究困難重重,亟需解決如下問題：1)RSV抗原表位完整性；2)機(jī)體Thl與Th2免疫應(yīng)答失衡導(dǎo)致VED；3)減毒潛在的危險(xiǎn)；4)PEI導(dǎo)致的CTL應(yīng)答削弱。近年來,病毒樣顆粒(VLP)組裝技術(shù)日益成熟,其優(yōu)勢逐漸凸顯。它是類似病毒自然形態(tài)的蛋白顆粒,模擬自然感染過程。因其缺乏核酸物質(zhì)無復(fù)制、重組、傳播能力,提高了安全性。現(xiàn)已有研究借助流感M蛋白實(shí)現(xiàn)VLP組裝,臨床前動(dòng)物試驗(yàn)具有良好的效果。但流感載體存在PEI,加大VED的風(fēng)險(xiǎn)。可見,選擇無PEI的病毒基質(zhì)蛋白應(yīng)用于RSVVLP組裝是發(fā)展疫苗的前提。我們所知,新城疫病毒(NDV)是不易感染人的禽源病毒,且基質(zhì)蛋白M、NP的VLP形成率較高。另外,NDV與RSV同屬副黏病毒屬,具有一定的同源性,易于組裝。由此可見,NDV的骨架蛋白是RSV形成VLP最佳載體。RSV是經(jīng)過粘膜,感染入侵人體。那么,粘膜免疫產(chǎn)生的sIgA可直接中和病毒,快速阻止其擴(kuò)散和傳播。同時(shí),它也可活化系統(tǒng)性免疫應(yīng)答,產(chǎn)生IgG中和抗體和CTL細(xì)胞應(yīng)答,有效地保護(hù)機(jī)體。另外,其免疫方式(滴鼻或無針注射)具有無痛優(yōu)勢,適用于嬰幼兒。由此可見,粘膜免疫在RSV的防護(hù)中發(fā)揮不可替代作用。現(xiàn)今,用于臨床治療RSV感染的藥物僅有Palivizumb和Ribavirin,可有效治療RSV引起的肺炎支氣管炎。但Palivizumb需反復(fù)注射才能達(dá)到治療效果,且費(fèi)用昂貴。而Ribavirin具有副作用,不適用于免疫缺陷人群。因此,研制開發(fā)新型RSV治療藥物并完善其治療策略對防控RSV感染意義重大。RSV致病機(jī)制對于其預(yù)防疫苗及治療藥物設(shè)計(jì)至關(guān)重要。迄今為止,RSV感染致病研究主要集中在RSV免疫逃逸機(jī)制、宿主免疫損傷及炎癥效應(yīng)。感染初期,RSV (NS1、NS2、G)可阻礙TLR信號通路,抑制IFN-I型應(yīng)答,避免天然免疫的抗病毒攻擊,完成自我復(fù)制,傳播至下呼吸道誘發(fā)肺部疾病。同時(shí),大量RSV聚集活化TLRs、RIG-I,誘導(dǎo)促炎基因表達(dá),產(chǎn)生大量的IL-2、IL-6、 TNF-α、CCL2、CCL3、IP-10等招募激活免疫細(xì)胞,侵入肺組織,造成肺部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致?lián)p傷�，F(xiàn)有研究表明RSV感染導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與其致病機(jī)制密切相關(guān)。RSV致病過程復(fù)雜,影響因素眾多,亟需深入探究。而尋找到宿主的易感基因及致死基因可為闡明RSV致病機(jī)制提供大量的試驗(yàn)素材。本研究立足于研發(fā)新型VLP疫苗、尋找藥物靶標(biāo)及提出創(chuàng)新理論體系,開展如下兩部分研究：重組RSVVLP疫苗的制備及免疫效果的初步研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康模褐苽浼霸u價(jià)重組RSV-VLP蛋白疫苗,為獲得RSV候選疫苗提供有力試驗(yàn)證據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法：選擇NDV為骨架,嵌合RSV的F和G蛋白,利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備重組RSV-VLP蛋白疫苗并進(jìn)行初步評價(jià)。首先將目的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,其次按照M-NP-F或M-NP-G順序相連,且兩兩之間加入SV40與polyhedron啟動(dòng)子,插入載體pFastBac I。當(dāng)雙酶切、PCR鑒定構(gòu)建成功后,將其桿粒轉(zhuǎn)入sf9獲得穩(wěn)定表達(dá)桿狀病毒,采用WB、電鏡證明VLP成功組裝。接下來,經(jīng)密度梯度離心純化后,滴鼻免疫小鼠,采用ELISA、ELISPOT對其免疫原性進(jìn)行評價(jià)。攻毒后,觀察小鼠體重、肺部病理及病毒載量指標(biāo),對VLPs免疫保護(hù)性進(jìn)行評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Westernblot檢測出RSV表面蛋白60KD的G蛋白和56KD的F蛋白,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)骨架蛋白51KD的NP和40KD的M均有表達(dá),電子顯微鏡觀察VLPs顆粒大小均一,NDV-VLP-G直徑集中在91-110nm：NDV-VLP-G直徑分布較大,約為51-130nm。上述結(jié)果證明VLPs組裝成功。小鼠評價(jià)試驗(yàn)證實(shí)：混合劑型rNDV/RSV/F+G免疫小鼠產(chǎn)生的系統(tǒng)性體液免疫、粘膜免疫及細(xì)胞免疫效果均優(yōu)于單一(rNDV/RSV/F或rNDV/RSV/G)免疫劑型。小鼠保護(hù)性試驗(yàn)證實(shí)：rNDV/RSV/F+G可以緩解小鼠體重下降,降低肺鼻的病毒載量,更重要的是能夠減少肺泡細(xì)胞炎癥因子的侵入,改善肺組織的纖維化,消除肺部的病灶,有效地保護(hù)小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：成功制備重組NDV-RSVVLPs,證實(shí)其能夠激活系統(tǒng)及粘膜免疫應(yīng)答,無VED。其中聯(lián)合免疫劑型rNDV/RSV/F+G的免疫保護(hù)效果均優(yōu)于單一免疫劑型,可能成為RSV潛力候選疫苗株,為其探究提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。RSV感染肺損傷機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康模航iRNA篩選平臺,尋找RSV易感及致死基因,探究其功能,為RSV感染致病機(jī)制提出新理論體系,同時(shí)也為RSV防治提供候選藥物靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)方法：篩選siRNA文庫,獲得有效基因,隨后進(jìn)行功能研究。首先,利用siRNA文庫,通過MTS方法檢測病毒感染后細(xì)胞活力變化,篩選RSV感染致死相關(guān)基因,獲得有效基因ACE2及MSK-2并繼續(xù)研究。接著通過收集臨床樣品,利用Westernblot、ELISA檢測AngⅡ、ACE2和ACE變化,通過體重變化、肺濕干比、病理變化完善小鼠肺損傷模型,深入探究ACE2功能。同時(shí),通過Westernblot檢測LC3Ⅱ含量轉(zhuǎn)化率,激光共聚焦技術(shù)觀測自噬小體變化建立RSV誘導(dǎo)自噬模型,結(jié)合siRNA敲除、抑制劑試驗(yàn),開展MSK-2的功能驗(yàn)證工作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成功建立篩選平臺,已篩選文庫基因達(dá)4000個(gè),成功獲得3個(gè)保護(hù)基因和10個(gè)致死基因。其中ACE2及MSK-2效果顯著且穩(wěn)定,進(jìn)行深入研究。經(jīng)過臨床標(biāo)本檢測及小鼠實(shí)驗(yàn)證明：ACE2在RSV感染導(dǎo)致肺損傷發(fā)揮重要作用。RSV感染過后ACE2降低影響血管緊張素2受體1(AT1R)變化進(jìn)而加重肺損傷。同時(shí)ACE2重組蛋白能夠有效地緩解RSV導(dǎo)致的肺損傷,為RSV防治提供了有效地藥物靶標(biāo)。通過RSV感染自噬模型的研究發(fā)現(xiàn),MSK-2可能通過調(diào)節(jié)LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化率參與調(diào)控RSV感染誘導(dǎo)的自噬,其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：人類全基因組siRNA文庫篩選可成功尋找到RSV感染及致死有效基因,為RSV機(jī)制研究提供豐富的試驗(yàn)素材及有效地作用靶點(diǎn)。本章節(jié)中篩選出保護(hù)基因ACE2能夠緩解RSV導(dǎo)致的肺損傷,為其治療提供創(chuàng)新藥物靶標(biāo)。而致死基因MSK-2可調(diào)節(jié)LC3轉(zhuǎn)化率進(jìn)而影響RSV誘導(dǎo)自噬,其功能亟需進(jìn)一步研究,也為RSV致病機(jī)制的自噬研究方向提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道合胞病毒 病毒樣顆粒疫苗 siRNA文庫篩選 血管緊張素轉(zhuǎn)移酶2 MSK-2
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-25
• 第一章 重組RSV VLP疫苗的制備及免疫效果初步研究25-51
• 第一節(jié) 重組RSV VLP疫苗的制備25-40
• 1. 材料與方法25-33
• 2. 結(jié)果33-37
• 3. 討論37-38
• 4. 結(jié)論38-40
• 第二節(jié) 重組RSV VLP蛋白疫苗免疫小鼠效果評價(jià)40-51
• 1. 材料與方法40-44
• 2. 結(jié)果44-49
• 3. 討論49-50
• 4. 結(jié)論50-51
• 第二章 RSV感染肺損傷機(jī)制的初步研究51-99
• 第一節(jié) RSV感染細(xì)胞死亡基因篩選及鑒定51-70
• 1. 材料與方法51-56
• 2. 結(jié)果56-66
• 3. 討論66-67
• 4. 結(jié)論67-70
• 第二節(jié) ACE2在RSV導(dǎo)致肺損傷的研究70-88
• 1. 材料與方法70-73
• 2. 結(jié)果73-86
• 3. 討論86-87
• 4. 結(jié)論87-88
• 第三節(jié) MSK-2在RSV誘導(dǎo)自噬的機(jī)制探究88-99
• 1. 材料與方法88-91
• 2. 結(jié)果91-98
• 3. 討論98
• 4. 結(jié)論98-99
• 全文總結(jié)99-100
• 參考文獻(xiàn)100-104
• 呼吸道合胞病毒中國展望104-114
• 參考文獻(xiàn)110-114
• 附表114-115
• 發(fā)表論文115-124
• 致謝124-127
• 個(gè)人簡歷127-128

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒的病毒樣顆粒疫苗制備及其感染導(dǎo)致肺損傷機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：339597