帕金森�。≒arkinson’s disease,PD）是僅次于老年癡呆癥的第二大神經(jīng)退行性疾病。1997年,在家族性PD患者腦內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)A53T突變型α-synuclein,它是最早被發(fā)現(xiàn)與PD相關(guān)的致病蛋白。A53T點(diǎn)突變會(huì)增加α-synuclein的表達(dá),增加α-synuclein的錯(cuò)誤折疊,形成更多的毒性聚集體。大量研究表明,在散發(fā)性PD患者腦內(nèi)也檢測(cè)到α-synuclein為主要成分的路易小體沉積。α-synuclein的異常在PD早期發(fā)生和病程發(fā)展中扮演了重要的角色,α-synuclein異常聚集出現(xiàn)早于PD典型運(yùn)動(dòng)癥狀,阻斷α-synuclein的聚集應(yīng)能減緩PD病程發(fā)展和改善癥狀。以α-synuclein或其寡聚體作為PD發(fā)病早期的臨床生物學(xué)標(biāo)志物,尋找更多的能夠有效降低α-synuclein寡聚體的化合物,對(duì)PD的治療具有重要的意義。螢光素酶的蛋白片段互補(bǔ)分析（Protein-fragment Complementation Assays,PCA）和雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）的方法被廣泛... 

【文章來源】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所)上海市

【文章頁(yè)數(shù)】：137 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

靶向毒性α-synuclein治療策略[60]

第1章引言101.5科學(xué)問題與研究意義A53T突變型α-synuclein是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與PD相關(guān)的致病蛋白[8]。PD早期發(fā)生和病程發(fā)展中α-synuclein的異常扮演了重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein異常聚集出現(xiàn)早于PD典型運(yùn)動(dòng)癥狀（圖1.3）[5,65]，阻斷α-synuclein的聚集應(yīng)能減緩PD病程發(fā)展和改善癥狀，提高患者的生存質(zhì)量�；衔锖Y選是新藥研發(fā)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。建立高通量的化合物篩選平臺(tái)并找到更多能夠有效降低α-synuclein寡聚體的化合物，對(duì)PD的治療具有重要意義。本課題將以α-synuclein為靶向，進(jìn)行抗PD化合物的篩選和研究。圖1.3PD病理學(xué)分期[65]Figure1.3SixstagesofPDpathology根據(jù)α-synuclein在腦內(nèi)的病理分布可分為六個(gè)分期。隨著病程發(fā)展，已受影響的腦內(nèi)病理會(huì)進(jìn)一步惡化，并且α-synuclein會(huì)擴(kuò)散到新的腦區(qū)域。a.α-synuclein的病理發(fā)展過程（箭頭）�？勺兊募t色陰影反映了疾病的病程以及病理的嚴(yán)重程度；b.第1階段：病變發(fā)生在嗅球、前嗅核、或腦干的迷走神經(jīng)和舌咽神經(jīng)的背側(cè)運(yùn)動(dòng)核。第2階段：在腦橋被蓋區(qū)（藍(lán)斑，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大細(xì)胞核和下縫核）中觀察到病變；c.第3階段和第4階段：病變到達(dá)腳橋核，基底前腦的膽堿能大細(xì)胞核，黑質(zhì)致密區(qū)（第3階段），下丘腦，以及顳葉內(nèi)側(cè)中間皮質(zhì)（階段4）。PD的最初臨床癥狀出現(xiàn)在3期或4期早期；d.階段5和6：病變到達(dá)新皮層高級(jí)相關(guān)區(qū)域（階段5），然后是一級(jí)相關(guān)區(qū)域和初級(jí)區(qū)域（階段6）。5、6期屬于臨床中晚期。

第1章引言111.6課題研究路線與方法為找到更多有效減少α-synuclein寡聚體的活性化合物并對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)體外水平的藥理學(xué)研究，本課題主要從以下兩個(gè)方面進(jìn)行展開：1.根據(jù)蛋白片段互補(bǔ)分析原理，建立促進(jìn)α-synuclein寡聚體解聚或降解的化合物篩選平臺(tái)（圖1.4）。將具有螢光活性的Gaussia螢光素酶在第93位氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行剪切拆成N端和C端兩部分序列[66]，分別與A53T突變（A53Tα-synuclein）序列接合構(gòu)建一對(duì)質(zhì)粒。SH-SY5Y細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，A53Tα-synuclein的相互作用可使Gaussia螢光素酶恢復(fù)生物活性，A53Tα-synuclein寡聚體形成越少，Gaussia螢光素酶的報(bào)告活性也越低。利用Gaussia螢光素酶蛋白片段互補(bǔ)分析平臺(tái)，篩選候選化合物。另外，建立Venus熒光蛋白互補(bǔ)分析平臺(tái)，將熒光蛋白Venus的N端（第173位氨基酸位點(diǎn)剪切）和C端序列（第155位氨基酸位點(diǎn)剪切）[67],分別與A53T突變序列接合構(gòu)建一對(duì)質(zhì)粒。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，通過熒光顯微鏡（Ex=515nm/Em=528nm）直接觀察黃色熒光蛋白Venus，間接表示細(xì)胞內(nèi)A53Tα-synuclein寡聚體的形成。同時(shí)檢測(cè)化合物處理后的細(xì)胞毒性，以排除因化合物細(xì)胞毒性而造成的篩選假陽(yáng)性結(jié)果。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并確定陽(yáng)性對(duì)照化合物。圖1.4化合物篩選平臺(tái)構(gòu)建的研究路線Figure1.4Researchroutesofestablishingcompoundsscreeningplatforms


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