目的:沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silencing information regulator 1,SIRT1）是影響腫瘤發(fā)生和進展的重要調(diào)節(jié)分子,但關(guān)于SIRT1在腫瘤（包括卵巢癌）中發(fā)揮促癌作用抑或抑癌作用至今仍存在爭議。早在十幾年前,就有文獻報道SIRT1存在核-質(zhì)穿梭過程,但對于SIRT1的亞細胞定位在卵巢癌中的作用目前仍知之甚少。本研究的目的是探討SIRT1亞細胞定位對卵巢癌細胞順鉑敏感性和遷移侵襲的影響及其相關(guān)機制。方法:1.通過構(gòu)建具有野生型SIRT1、核輸出序列（Nuclear Export Sequences,NESs）突變型SIRT1(SIRT1^NESmt)和核定位序列（Nuclear Localization Sequences,NLSs）突變型SIRT1(SIRT1^NLSmt)編碼序列的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人類卵巢癌IGROV1細胞和HEY細胞,通過篩選獲得過表達野生型SIRT1、NESs突變型SIRT1和NLSs突變型SIRT1的卵巢癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(以下簡稱為SIRT1細胞、SIRT1^NESmt細胞和S... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

熒光顯微鏡下觀察對照組（Con136）中的GFP以及SIRT1細胞、SIRT1NESmt細胞和SIRT1NLSmt細胞中的SIRT1-GFP融合蛋白

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文-45-圖1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中外源性SIRT1表達檢測（A、B）顯示通過real-timePCR檢測IGROV1系列細胞和HEY系列細胞中SIRT1mRNA相對表達水平（n=3；ns，無統(tǒng)計學意義；***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，均與Con136比較）。（C、D）顯示W(wǎng)esternblot對各組細胞中SIRT1水平的檢測。SIRT1表示細胞內(nèi)源性SIRT1，SIRT1-GFP代表外源性SIRT1；Actin用作衡量各組中蛋白上樣量的內(nèi)參蛋白。Figure1.2DetectionofSIRT1expressioninstablytransfectedcellsSIRT1mRNAlevelsmeasuredbyreal-timePCRinIGROV1andHEYcellgroups(parentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NESmtandSIRT1NLSmtcells)wereshownin(A)and(B).Eachbarrepresentedthemean±SD(n=3;ns,notsignificant;***,P<0.001;**,P<0.01;*,P<0.05).ProteinlevelsofendogenousSIRT1andexogenousSIRT1-GFPdeterminedbyWesternblotanalyseswereshownin(C)and(D).Actinwasusedastheloadingcontrol.接下來我們分離提取各組細胞的細胞質(zhì)、細胞核組分，進行了Westernblot檢測，以進一步確定NESs序列和NLSs序列突變是否能夠影響外源性SIRT1的表達，影響其亞細胞的分布。從圖1.3中Westernblot檢測結(jié)果可以看出，SIRT1NESmt細胞中SIRT1-GFP的胞

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文-46-核分布顯著增加，符合我們設(shè)計之初的預(yù)想，即通過突變核輸出序列限制SIRT1出核，以達到提高其胞核定位的目的。SIRT1NLSmt細胞中SIRT1-GFP的胞核分布顯著減少，絕大多數(shù)集中于胞質(zhì)中，也提示我們通過核定位序列突變，阻礙了SIRT1向核內(nèi)的運輸，從而使其在細胞質(zhì)中富集。上述結(jié)果顯示，我們的構(gòu)建策略有效地影響了SIRT1的核-質(zhì)穿梭，獲得了過表達不同亞細胞定位SIRT1的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。圖1.3卵巢癌細胞胞質(zhì)和胞核組分中內(nèi)源性SIRT1和外源性SIRT1-GFP的表達情況Tubulin和LaminB分別用作細胞質(zhì)和細胞核的內(nèi)參蛋白。Figure1.3SIRT1expressionincytoplasmicandnuclearextractsfromparentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NLSmtandSIRT1NLSmtcellsTubulinandlaminBwereusedasthecytoplasmicandnuclearloadingcontrols,respectively.3.2各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞SIRT1去乙�；腹δ艿臋z測及比較由于SIRT1是去乙酰化酶，我們在改變其亞細胞定位的同時應(yīng)確保其去乙�；傅墓δ懿皇苡绊懀绻該p害其酶活性為代價改變亞細胞定位，勢必會大大減弱我們研究的意義，于是我們設(shè)法對各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中SIRT1的去乙酰化酶活性進行了評估。p53是SIRT1去乙�；饔玫囊阎蟹肿�，其382位賴氨酸殘基（lys382，K382）的乙�；癄顟B(tài)可以被SIRT1解除，因此比較K382位點乙酰化p53（Ac-K382p53）的水平可以相對衡量各組細胞間外源性SIRT1的去乙�；富钚�。但p53作為促凋亡蛋白，在正常情況下其本底水平較低且半衰期短，當細胞遭遇細胞毒性或DNA損傷事件時，其表達水平和乙酰化水平明顯增加，阻斷細胞周期，促使細胞進行損傷修復(fù)，或者進入細胞死亡的程序。因此，我們對IGROV1的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞給予了順鉑處理，以誘導p53的表達和乙�；降脑�


本文編號：3324879