雙底物特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶 1A（dual-specificity tyro-sine-（Y）-phosphorylation-regulated kinase 1A,DYRK1A）在胰腺癌以及糖尿病中高表達(dá)并異常激活,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及胰島β細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。因此,靶向DYRK1A抑制劑的研發(fā)成為治療胰腺癌和糖尿病的一個新的研究方向。首先通過基因工程技術(shù)對重組人源性DYRK1A蛋白進(jìn)行表達(dá)純化,獲得了大量且高純度的重組人源性DYRK1A蛋白;利用重組DNA技術(shù)將DYRK1A目的基因構(gòu)建到新的表達(dá)載體pNIC28-Bsa4上,并實現(xiàn)了 DYRK1A基因的穩(wěn)定存在和高效克隆。利用課題組從甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）和瘤毛獐牙菜（Swertia pseudochinensis Hara）植物中提取分離得到的天然產(chǎn)物小分子化合物,通過體外激酶實驗篩選得到了DYRK1A抑制劑,其中異戊烯基取代的化合物甘草香豆酮（licocoumarone,LC）和根據(jù)去甲基雛菊葉龍膽酮（demethylbellidifolin,DMB）結(jié)構(gòu)改造通過化學(xué)合成得到的化合... 

【文章來源】：沈陽藥科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語簡表
第一章 緒論
    一、DYRK1A蛋白激酶的三維立體結(jié)構(gòu)
        1.1 結(jié)構(gòu)組成
        1.2 DYRK1A的分布與功能
    二、DYRK1A生理與病理作用
        2.1 DYRK1A在神經(jīng)病變中的作用研究
        2.2 DYRK1A在腫瘤形成中的作用研究
        2.3 DYRK1A在糖尿病中的作用研究
    三、DYRK1A抑制劑的發(fā)現(xiàn)
    四、計算機(jī)輔助藥物設(shè)計
        4.1 基于配體的藥物設(shè)計
        4.2 基于受體的藥物設(shè)計
    五、立題依據(jù)
第二章 DYRK1A蛋白的表達(dá)與純化
    一、實驗材料與儀器
        1.1 宿主菌和重組質(zhì)粒載體
        1.2 實驗儀器
        1.3 生化試劑
            1.3.1 工具酶
            1.3.2 試劑盒
            1.3.3 化學(xué)試劑
        1.4 表達(dá)用載體質(zhì)粒
        1.5 引物
        1.6 常用溶液的配制
            1.6.1 蛋白表達(dá)所需溶液配制
            1.6.2 SDS-PAGE (Tris-glycine系統(tǒng))
        1.7 蛋白濃度測定
        1.8 目的基因
    二、實驗方法
        2.1 目的基因PCR及克隆
        2.2 重組質(zhì)粒與表達(dá)載體的連接
        2.3 目的蛋白表達(dá)鑒定
            2.3.1 小量培養(yǎng)鑒定重組蛋白表達(dá)水平
            2.3.2 蛋白大量表達(dá)
        2.4 所需工具酶TEV蛋白酶的表達(dá)和純化
    三、實驗結(jié)果
        3.1 以pNIC28-Bsa4為載體的DYRK1A蛋白的表達(dá)與純化
            3.1.1 基因克隆以及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.1.2 DYRK1A蛋白表達(dá)小量檢測結(jié)果
            3.1.3 DYRK1A蛋白大量純化-親和層析純化結(jié)果
            3.1.4 DYRK1A蛋白大量純化-離子交換層析結(jié)果
            3.1.5 TEV蛋白酶表達(dá)純化結(jié)果
            3.1.6 DYRK1A蛋白大量純-TEV酶酶切后凝膠過濾柱層析結(jié)果
        3.2 DYRK1A-pET28a蛋白表達(dá)純化檢測結(jié)果
            3.2.1 DYRK1A-pET28a蛋白表達(dá)小量檢測結(jié)果
            3.2.2 DYRK1A蛋白大量純化的結(jié)果
    四、討論
    五、小結(jié)
第三章 基于DYRK1A結(jié)構(gòu)的小分子化合物的活性評價及結(jié)構(gòu)優(yōu)化
    第一節(jié) 甘草小分子天然產(chǎn)物抗腫瘤作用研究
        一、實驗材料與儀器
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗儀器
            1.3 植物材料
        二、實驗方法
            2.1 體外DYRK1A激酶活性實驗
            2.2 分子對接
            2.3 微量熱泳動實驗(MST)
            2.4 DARTS靶點(diǎn)驗證實驗
            2.5 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.6 細(xì)胞活性檢測
            2.7 Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞增殖實驗
                2.7.1 Edu檢測細(xì)胞增殖實驗
                2.7.2 細(xì)胞劃痕實驗
                2.7.3 平板克隆實驗
            2.8 Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞凋亡檢測
                2.8.1 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡
                2.8.2 Heochst 33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡
            2.9 免疫蛋白印跡
            2.10 統(tǒng)計學(xué)處理
        三、實驗結(jié)果
            3.1 DYRK1A酶抑制活性的測定結(jié)果
            3.2 分子對接預(yù)測LC與DYRK1A的結(jié)合方式
            3.3 LC與DYRK1A結(jié)合能力的測定結(jié)果
            3.4 DARTS靶點(diǎn)驗證結(jié)果
            3.5 LC抑制過表達(dá)DYRK1A的Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞系的生長
            3.6 LC抑制Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞的增殖
                3.6.1 Edu檢測細(xì)胞增殖的實驗結(jié)果
                3.6.2 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果
                3.6.3 平板克隆實驗結(jié)果
            3.7 Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果
                3.7.1 流式細(xì)胞儀檢測Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞凋亡結(jié)果
                3.7.2 Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察
            3.8 LC抑制DYRK1A促進(jìn)c-MET的降解
        四、討論
        五、小結(jié)
    第二節(jié) 1,3,5,8-四羥基吖啶酮類化合物的設(shè)計、合成及活性評價
        一、實驗試劑與儀器
            1.1 實驗試劑
            1.2 實驗儀器
            1.3 顯色方法
        二、吖啶酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與合成路線
            2.1 1,3,5,8-四羥基吖啶酮的合成
                2.1.1 2,5-二羥基苯甲酸甲酯的合成
                2.1.2 氧化銀氧化2,5-二羥基苯甲酸甲酯
                2.1.3 合環(huán)反應(yīng)
                2.1.4 脫甲基化反應(yīng)
            2.2 體外DYRK1A激酶活性實驗
            2.3 分子對接
        三、實驗結(jié)果
            3.1 Swertia pseudochinensis Hara獐牙菜屬小分子化合物構(gòu)效關(guān)系探討
            3.2 波譜數(shù)據(jù)
            3.3 DYRK1A酶抑制活性的測定結(jié)果
            3.4 分子對接預(yù)測化合物與DYRK1A的結(jié)合方式
                3.4.1 預(yù)測DMB與DYRK1A結(jié)合方式
                3.4.2 預(yù)測2-2與DYRK1A結(jié)合方式
                3.4.3 對接打分
                3.4.4 對接復(fù)合物的氫鍵作用
        四、討論
        五、小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士期間論文發(fā)表目錄
致謝
附件



本文編號：3295586