背景:Gasdermin家族D蛋白（GSDMD）是炎性caspase介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡和白細(xì)胞介素-1beta（IL-1β）釋放的關(guān)鍵底物蛋白,目前對其研究主要集中于微生物引起的感染性炎癥。高遷移率族蛋白B1（High mobility group box-1,HMGB1）作為一種警報素分子參與包括缺血再灌注損傷在內(nèi)的多種疾病的致病過程。甘草甜素是一種天然的三萜類化合物,因其抗炎抗病毒活性被廣泛應(yīng)用于肝炎等疾病的臨床治療。最近有研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素可以通過抑制HMGB1的表達(dá)和活性減輕缺血再灌注引起的肝臟損傷,但是具體的作用機(jī)制尚不十分清楚。目的:本課題以缺血再灌注所致的小鼠肝臟損傷為模型,探討甘草甜素參與肝臟缺血再灌注損傷的作用及可能機(jī)制。方法與結(jié)果:1.甘草甜素減輕缺血再灌注引起的小鼠肝組織損傷建立小鼠肝臟缺血再灌注模型,缺血90分鐘后恢復(fù)肝臟供血。在恢復(fù)血供6小時后,采集小鼠靜脈血并檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量;取小鼠肝組織,將組織固定、包埋后,制成石蠟切片并進(jìn)行H&E染色檢測肝組織損傷情況,利用免疫組化和髓過氧化物酶活性檢測中性粒細(xì)胞的浸潤。2.甘草甜素減輕肝臟缺... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

甘草甜素減輕缺血再灌注引起的小鼠肝組織損傷A.血清ALT水平（mean±SE，n=6；*,P<0.05vsshamcontrol.**,P<0.05vsI/R）；B.血清AST水平（mean±SE，n=6；*,P<0.05vsshamcontrol.**,P<0.05vsI/R）；C.肝組織病理學(xué)評分（mean±SE，n=6；*,P<0.05vsshamcontrol.**,P<0.05vsI/R）；

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文36A.肝組織HMGB1免疫組化檢測；B.肝組織NLRP3免疫組化檢測；C.肝組織F4/80免疫熒光檢測；D.F4/80細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計（mean±SE，n=6；*,P<0.05vsshamcontrol.**,P<0.05vsI/R）。2.1.2甘草甜素抑制肝臟缺血再灌注引起的庫普否細(xì)胞焦亡。為了進(jìn)一步確證庫普否細(xì)胞死亡的途徑，接下來提取再灌注后小鼠肝臟內(nèi)的庫普否細(xì)胞，置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時后收集細(xì)胞上清液，利用ELISA法檢測釋放入上清中有活性的IL-1β的含量；同時，將細(xì)胞裂解提取蛋白，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。如圖2-2A所示，缺血再灌注引起的上清細(xì)胞因子IL-1β水平升高受到甘草甜素的抑制；這一現(xiàn)象在westernblot實(shí)驗結(jié)果中也得到了驗證，缺血再灌注能夠上調(diào)IL-1βP17（其活體形式）的表達(dá)，給予甘草甜素時表達(dá)下調(diào)。如圖2-2B所示，缺血再灌注能夠促進(jìn)caspase-1和GSDMD的激活；甘草甜素使HMGB1表達(dá)水平明顯降低，同時激活的caspase-1P20和GSDMD-N30也受到抑制，它們的前體蛋白的表達(dá)則不受影響。圖2-2甘草甜素抑制肝臟缺血再灌注引起的庫普否細(xì)胞焦亡

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文37A.ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量（mean±SE，n=6；*,P<0.05vsshamcontrol.**,P<0.05vsI/R）；B.Westernblot檢測細(xì)胞胞漿蛋白的表達(dá)。2.1.3甘草甜素可能通過抑制內(nèi)源性HMGB1減少缺氧－復(fù)氧誘導(dǎo)的庫普否細(xì)胞焦亡。為了闡明甘草甜素影響肝臟缺血再灌注引起的庫普否細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制，本課題建立了一種體外缺氧－復(fù)氧細(xì)胞培養(yǎng)模型。由于IL-1β的釋放需要兩個步驟：即IL-1β前體的產(chǎn)生和IL-1β前體的激活，本研究應(yīng)用LPS對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激以激活NF-κB信號轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量IL-1β前體，再對細(xì)胞進(jìn)行缺氧－復(fù)氧刺激。結(jié)果顯示（如圖2-3），只有先后進(jìn)行兩種信號刺激時才能在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到具有活性的IL-1β，單獨(dú)給予LPS或缺氧－復(fù)氧刺激均不能檢測到激活的IL-1β的釋放。圖2-3體外缺氧－復(fù)氧細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立A.ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量（mean±SE，n=6；*,P<0.05vscontrol）；B.免疫熒光檢測細(xì)胞NF-κB的激活。在缺氧－復(fù)氧的基礎(chǔ)上向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入甘草甜素，如圖2-4A所示，結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗相一致，甘草甜素可以降低細(xì)胞上清中IL-1β的釋放和細(xì)胞內(nèi)HMGB1水平，抑制IL-1β、caspase-1和GSDMD的激活（圖2-4B）。并且甘草甜素含量越高，抑制

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3275485