背景和目的:骨質(zhì)疏松的主要特征是是骨組織的微結(jié)構(gòu)破壞,單位結(jié)構(gòu)內(nèi)骨量下降及骨的脆性增加。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal cells,hBMSCs）的成骨分化對(duì)于骨骼生成十分重要,是目前骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制和治療的重點(diǎn)研究方向。新的證據(jù)表明,長鏈非編碼RNA（long-noncoding RNA,lncRNA）在hBMSCs的成骨分化中發(fā)揮重要作用。MALAT1通常被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)lncRNA,它在間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用目前尚不清楚。1α,25-二羥維生素D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25（OH）₂D₃]和25-羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3,25（OH）D₃]可以刺激hBMSCs的成骨分化。25（OH）D₃需要在細(xì)胞內(nèi)由1α羥化酶（Cytochrome P450 27B1,1α-hydroxylase/CYP27B1）轉(zhuǎn)化為1α,25（OH）₂D₃... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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體內(nèi)維素D的代謝示意圖

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文17性形式，但卻是維生素D的主要存在形式，因此血清中維生素D的濃度主要以25(OH)D的濃度作為檢測指標(biāo)。在血液循環(huán)中，維生素D像其他類固醇激素一樣，絕大部分（大約85-90%）與特殊的載體維生素D結(jié)合蛋白（DBP）緊密結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸，少量（大約10-15%）與血清白蛋白松散地結(jié)合，只有極少量（少于0.03%）以游離的形式存在[63]（圖2）。血清中25(OH)D的濃度大約為20-80ng/mL，而1α,25(OH)2D的濃度僅為25(OH)D的1/1000。在血清中，DBP的濃度約為所有維生素D代謝形式總濃度的20倍。因此在血清中，超過99%的維生素D以結(jié)合為復(fù)合體的形式存在[64,65]。對(duì)于1α,25(OH)2D，由于其含有一個(gè)多余的羥基，這使得其與DBP結(jié)合的親和力僅僅是25(OH)D的1/10到1/100[66]，因此在血清中，一部分1α,25(OH)2D可以以游離的形式存在，但由于其在血清中并不是主要存在形式，其濃度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于25(OH)D。圖2：液循環(huán)中25(OH)D的分布示意圖（引自Tsuprykov等2018）Figure2:Aschematicdrawingshowingthedistributionof25(OH)Dinthecirculatingblood.(CitedfromTsuprykovetal2018)維生素D的入胞由于血清中的25(OH)D主要以25(OH)D-DBP復(fù)合體的形式存在，其進(jìn)入細(xì)胞需通過細(xì)胞膜上的受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在腎小球上皮細(xì)胞和乳腺細(xì)胞中，25(OH)D以25(OH)D-DBP復(fù)合體的形式，由megalin特異性結(jié)合DBP，在cubilin的協(xié)助下將25(OH)D轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，25(OH)D便不再結(jié)合于DBP，在CYP27B1的作用下生成1α,25(OH)2D，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合VDR發(fā)揮其生物學(xué)作用。Megalin對(duì)于維生素D內(nèi)吞的必要性已經(jīng)有體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，megalin缺失的小鼠[67]和cubilin突變的狗[68]均表現(xiàn)出繼發(fā)于腎臟細(xì)胞攝取25(OH)D-DBP復(fù)合體并轉(zhuǎn)化為1α,25(OH)2D障礙的維

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文36培養(yǎng)箱內(nèi)成骨誘導(dǎo)21d，每2天更換一次OM。21d后終止誘導(dǎo)，PBS洗滌2遍（注意動(dòng)作一定輕柔），4%多聚甲醛室溫下固定20min，PBS洗滌2遍，每孔加入1ml茜素紅染液，染色20min后，吸走染液，PBS洗滌3遍，觀察拍照。1.3.18統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表述出來，兩組間比較采用one-wayANOVA或StudentT-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。*p<0.05記為有顯著性差異。1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.4.1hBMSCs的分離和鑒定目前有很多種方法可以分離hBMSCs，例如免疫磁珠法、血細(xì)胞完全貼壁法以及密度梯度離心法等。我們采用的是密度梯度離心法（圖1A）進(jìn)行hBMSCs的分離，被接種于培養(yǎng)皿的細(xì)胞包含造血細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞等。經(jīng)過2-3天的培養(yǎng)及換液后，包括破骨細(xì)胞等在內(nèi)的非粘附性造血譜系細(xì)胞在換液后被清除，從而使粘附的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入快速生長期，并大量克攏圖1：hBMSCs分離過程（引自Geng等2013）Figure1:IsolationofhBMSCs.(CitedfromGengetal2013)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Two-year clinical outcome of denosumab treatment alone and in combination with teriparatide in Japanese treatment-naive postmenopausal osteoporotic women[J]. Yukio Nakamura,Takako Suzuki,Mikio Kamimura,Shota Ikegami,Kohei Murakami,Shigeharu Uchiyama,Akira Taguchi,Hiroyuki Kato.  Bone Research. 2017(02)
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