本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-206對實驗性心房顫動犬心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：心房顫動(房顫,AF)是最嚴重的心房電活動紊亂,具有較高的致殘率與死亡率,其發(fā)病率逐年增高,嚴重影響了患者的健康狀況與生活質(zhì)量,帶來了沉重的社會負擔,但發(fā)生機制仍不十分明了。早在1995年,就有研究發(fā)現(xiàn)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)在房顫的發(fā)生與維持中具有重要作用。近來,心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu),即心臟交感與迷走神經(jīng)的再生與不均一分布,被證實為房顫的重要發(fā)病機制。心臟神經(jīng)支配主要涉及心臟外在自主神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)。前者由腦、脊髓與心臟神經(jīng)叢(GP)之前的神經(jīng)纖維構(gòu)成；后者則由心臟表面的神經(jīng)叢及其神經(jīng)纖維構(gòu)成。神經(jīng)叢實際上是交感與迷走神經(jīng)末梢在心臟表面的“集散地”,在心臟表面被心臟脂肪墊所包繞,其神經(jīng)分布比心房的其他部位更加密集。在哺乳動物,心臟主要神經(jīng)叢均位于肺靜脈根部,分別稱為上左、下左、前右與下右神經(jīng)叢。心房以及肺靜脈周圍的神經(jīng)重構(gòu)已有報道,但是神經(jīng)叢及其周圍的神經(jīng)重構(gòu)現(xiàn)象以及分子生物學機制還不明了。MicroRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一類較短的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行負調(diào)控,參與多種疾病的發(fā)病機制,如神經(jīng)退行性疾病、多種代謝性疾病及心血管系統(tǒng)疾病等。大量證據(jù)表明,多種miRNA參與房顫的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)的發(fā)病過程,并在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病中扮演重要角色。研究顯示心臟外在自主神經(jīng)系統(tǒng)有特定的miRNA表達譜,而心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)是否有miRNA的不同程度表達,及對房顫的發(fā)生與發(fā)展有何作用,至今仍無具體研究結(jié)論。本研究旨在探討快速右心房起搏后犬的心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu),并從miRNAs的角度研究自主神經(jīng)的重構(gòu)的分子機制,為房顫的治療提供理論依據(jù),主要包括兩個部分：第一部分：實驗性房顫犬心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)及miRNA表達譜的研究研究目的越來越多的證據(jù)顯示,心臟神經(jīng)重構(gòu)為房顫的重要發(fā)病機制,但心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng),尤其是神經(jīng)叢的神經(jīng)重構(gòu)是否能誘發(fā)并維持房顫,以及房顫內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)中miRNAs的表達變化及潛在作用機制仍不明了。本實驗旨在探討持續(xù)性快速右心房起搏后犬上左神經(jīng)叢(SLGP)是否發(fā)生神經(jīng)重構(gòu),并采用高通量測序方法篩選房顫犬心臟SLGP中明顯變化的miRNA,從niRNA的角度揭示心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的分子機制,為房顫的防治提供理論依據(jù)。材料與方法1、房顫犬模型制作健康成年雜種犬12只,雌雄不拘,被隨機分成兩組,分別為對照組與心房快速起搏組(A-TP)。A-TP組以400次／分持續(xù)右心房起搏4周。2、心臟電生理指標的檢測起搏結(jié)束后,開胸,測定左心房后壁上左神經(jīng)叢附近的心房有效不應(yīng)期(AERP)。 AERP定義為不引起心房激動的最長S1S2間期。房顫由高頻刺激誘發(fā),成功的房顫的誘導(dǎo)定義為持續(xù)快速不規(guī)則的心房率超過30秒。然后,取左上脂肪墊(LSFP)及其周圍0.5厘米的心房組織。3、免疫組化分析對神經(jīng)相關(guān)分子指標進行免疫組化染色,包括：酪氨酸羥化酶(TH,交感神經(jīng)的標志物)與乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT,副交感神經(jīng)的標志物),計算對照組與起搏組的神經(jīng)密度,來反映神經(jīng)重構(gòu)現(xiàn)象。4、高通量測序應(yīng)用Illumina HiSeq二代測序系統(tǒng)對miRNA進行高通量測序,與犬miRNA數(shù)據(jù)庫進行全基因組比較,鑒定犬心臟脂肪墊中miRNA的差異表達。并應(yīng)用qRT-PCR方法,對測序結(jié)果進行驗證。結(jié)果在右心房快速起搏組中,心房有效不應(yīng)期明顯縮短,TH、ChAT陽性的神經(jīng)密度均明顯上升。對兩組進行測序后,總共檢測到241種miRNA表達,其中16種miRNAs的表達有顯著差異。6種miRNA的表達明顯上調(diào),包括miR-206,miR-208b, miR-21, miR-224, miR-451, miR-450b,另10種miRNA的表達明顯下調(diào),包括miR-129, miR-138a, miR-34c, miR-7, miR-449, miR-205, miR-203, miR-137, miR-124, miR-202。qRT-PCR結(jié)果表明miR-206, miR-224, miR-137與miR-203的差異表達與測序結(jié)果相符。結(jié)論實驗性房顫犬模型中,在心臟上左神經(jīng)叢部位,發(fā)生明顯的神經(jīng)重構(gòu)現(xiàn)象,高通量測序篩選出多種miRNA的差異表達,差異表的miRNAs可能參與房顫內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)。創(chuàng)新性1.應(yīng)用犬制作快速心房起搏動物模型,并觀察犬心臟神經(jīng)叢的神經(jīng)重構(gòu)現(xiàn)象。2.應(yīng)用高通量測序檢測心房快速起搏犬心臟神經(jīng)叢中miRNAs的表達變化,從miRNA的角度探討心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)。第二部分：MicroRNA-206通過調(diào)節(jié)SOD1的表達促進房頗心臟自主神經(jīng)重構(gòu)的機制研究研究目的先前的研究發(fā)現(xiàn),miR-206在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)均有特異表達,且在神經(jīng)損傷后促進神經(jīng)再生,而在心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)中的表達及作用還不明了。本實驗選取高通量測序右心房快速起搏犬中差異表達明顯的miR-206,采用慢病毒感染、免疫組化及多種分子生物學手段,通過體內(nèi)實驗及體外試驗來研究miR-206對心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的影響,揭示miR-206對靶基因及其對下游通路的調(diào)控機制。材料與方法1、實驗分組及慢病毒的感染在動物水平,選取30只雜種犬,隨機分為5組。分組如下：1)慢病毒對照組：不起博,在LSFP中感染陰性對照慢病毒2周；2)起搏組(n=6),快速右房起搏后,犬心臟LSFP內(nèi)注射陰性對照慢病毒2周；3)A-TP+miR-206過表達組：起博4周后,在LSFP中感染miR-206過表達的慢病毒2周;4)A-TP+miR-206沉默組：起博4周后,在LSFP中感染miR-206沉默的慢病毒2周；5)miR-206過表達組：不起博,僅在犬的LSFP中感染miR-206過表達的慢病毒2周。在細胞水平,分離對照組犬心房LSFP及其附近0.5厘米內(nèi)的心肌細胞,應(yīng)用輔加10%的胎牛血清與雙抗的DMEM進行原代心肌細胞培養(yǎng)。miR-206過表達、沉默及超氧化物歧化酶(SOD1)基因沉默的慢病毒分別感染各組細胞48小時,陰性對照慢病毒感染對照慢病毒組。2、AERP的檢測及房顫的誘導(dǎo)通過多通道程序刺激儀分別對照組、起搏組、起搏+感染組進行電生理檢查,測定左心房LSFP附近的AERP。應(yīng)用高頻刺激誘導(dǎo)房顫。3、免疫組化分析與Western Blot對神經(jīng)相關(guān)分子指標進行免疫組化染色,包括：蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5,神經(jīng)元及神經(jīng)纖維生長的標記物)、TH與ChAT,計算交感與迷走神經(jīng)的密度。應(yīng)用Western Blot方法檢測SOD1與GAPDH的蛋白表達水平。4、熒光素酶分析報告構(gòu)建預(yù)測的靶基因SOD1的3'-UTR端野生型及miR-206的結(jié)合位點缺失型熒光素酶載體。用雙熒光素報告分析系統(tǒng)來檢測熒光素酶活性,用于驗證SOD1基因為miR-206的靶基因。5、ROS的檢測應(yīng)用活性氧(ROS)敏感的2’,7’-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCF-DA)檢測細胞中ROS的水平。DCF熒光的水平可反映ROS的濃度。在動物組織中,在488nm的可見光下檢測DCF的熒光水平。6、miR-206下游基因的芯片分析取感染miR-206的過表達組與陰性對照組的組織標本,應(yīng)用表達譜芯片進行篩選miR-206的下游基因,并行GO分析以及KEGG通路分析來定義下游基因的生物學功能。應(yīng)用qRT-PCR方法來驗證分析結(jié)果。結(jié)果1、miR-206的表達上調(diào)促進心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)并易化房顫的發(fā)生(1)A-TP組犬的AERP明顯縮短,而A-TP基礎(chǔ)上miR-206的表達上調(diào)進一步使AERP縮短,并使房顫的誘發(fā)性增加,而沉默miR-206使AERP延長。(2)miR-206的過表達與A-TP均使PGP9.5、TH、ChAT陽性的神經(jīng)密度明顯上升,而miR-206的表達下降使以上神經(jīng)密度明顯下降。(3)miR-206的過表達會引起pGL3-SOD1-UTR-野生型細胞熒光素酶活性的顯著降低,SOD1基因的3'UTR區(qū)的缺失可以抑制上述熒光素酶活性的降低,說明SOD1的3'UTR區(qū)域中包含miR-206的結(jié)合位點。驗證了SOD1是miR-206的靶基因。(4)動物實驗顯示miR-206的過表達可減少SOD1的表達至對照組的48%,A-TP組中SOD1的表達降至對照組的39%,而A-TP后的miR-206的表達上調(diào)使SOD1下降至A-TP組的34%,說明miR-206負調(diào)控SOD1。(5)體外實驗中,miR-206的過表達使ROS水平增加了近2倍,miR-206的沉默明顯降低了ROS水平至對照組的50%。動物實驗中,獲得了相似的結(jié)果,miR-206過表達的犬中ROS水平上升至1.6倍,A-TP組中ROS水平也有明顯增加,A-TP后miR-206過表達使ROS水平增加更明顯。通過沉默SOD1基因,ROS水平上升至1.4倍,且miR-206沉默介導(dǎo)的ROS水平的下降可被SOD1基因的沉默逆轉(zhuǎn)。驗證了miR-206通過調(diào)節(jié)SOD1的表達來調(diào)控ROS的水平。2、miR-206調(diào)節(jié)下游多種mRNA的表達芯片分析顯示miR-206過表達后,有1254種mRNA顯示表達差異2倍以上。GO分析及KEGG通路分析表明這些mRNA涉及到神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)等多條信號通路,顯示miR-206通過多條信號通路影響心臟自主神經(jīng)重構(gòu)過程。結(jié)論在房顫的自主神經(jīng)重構(gòu)過程中,miR-206通過促進心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)進而影響心臟電生理特性的改變來誘發(fā)房顫。其潛在的機制可能與miR-206調(diào)節(jié)靶基因SODl的表達,后者進一步增加ROS水平以及調(diào)控多條下游信號通路有關(guān)。創(chuàng)新性1.制作快速心房起搏犬模型,并檢測miR-206在心臟神經(jīng)叢中的表達變化及對神經(jīng)重構(gòu)的影響；2.心臟脂肪墊內(nèi)活體注射miR-206過表達及沉默慢病毒,研究miR-206通過調(diào)控靶基因SOD1及下游信號通路來影響心臟自主神經(jīng)重構(gòu)的作用機制。
【關(guān)鍵詞】：心房顫動 內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu) miRNAs 高通量測序 心房纖顫 心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu) miR-206 SOD1 ROS
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.75
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符號說明21-23
• 引言23-24
• 第一部分 實驗性房顫犬心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)及miRNA表達譜的研究24-48
• 前言24-27
• 材料與方法27-34
• 結(jié)果34-38
• 討論38-41
• 小結(jié)41-42
• 參考文獻42-48
• 第二部分 MicroRNA-206通過調(diào)節(jié)SOD1的表達促進房顫心臟自主神經(jīng)重構(gòu)的機制研究48-84
• 前言48-49
• 材料與方法49-63
• 結(jié)果63-76
• 討論76-79
• 小結(jié)79-80
• 參考文獻80-84
• 系統(tǒng)綜述 心臟去自主神經(jīng)治療對心房顫動的療效研究-薈萃分析84-103
• 摘要84-85
• 前言85-86
• 方法86-89
• 結(jié)果89-94
• 討論94-96
• 小結(jié)96-97
• 附表97-99
• 參考文獻99-103
• 致謝103-104
• 攻讀學位期間論文發(fā)表情況和課題題目104-106
• 學位論文評閱及答辯情況表106-107
• 英文論文Ⅰ107-130
• 英文論文Ⅱ130-149

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