肺癌是目前全球高發(fā)的癌癥之一,它具有高死亡率以及預后差等特點,然而目前針對于肺癌,并沒有非常有效的治療手段。近些年,隨著細胞治療的發(fā)展,CAR-T細胞治療的研究和臨床實驗也在如火如荼的進行中。CAR-T細胞治療是將T細胞從病人外周血中分離出來,經(jīng)過體外的活化后利用慢病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒或者電轉(zhuǎn)染等方式對T細胞進行轉(zhuǎn)染,使其能夠過表達CAR序列,而后通過一系列的檢測和質(zhì)控,再回輸入病人的體內(nèi)達到靶向殺傷腫瘤的目的。在過去的一些報道和臨床實驗中,雖然CAR-T細胞對于血液腫瘤有著良好的殺傷效果,但是對于實體腫瘤的治療一直效果欠佳,主要原因包括:1、腫瘤微環(huán)境是一個免疫抑制的環(huán)境,存在大量免疫抑制細胞和細胞因子;2、缺乏特異性有效的靶點。前期研究證實肺癌細胞特異性高表達LunX蛋白,且用LunX單克隆抗體S-35-8治療肺癌小鼠模型取得了很好的療效,那么制備針對LunX蛋白的CAR-T細胞可能對肺癌也有著很好的治療效果�；诖�,我們展開了對針對LunX抗原的CAR-T細胞研究,并取得了如下結果:1、LunX特異性CAR-T細胞的構建我們使用SPR檢測了 LunX蛋白單克隆抗體S-35-8與Lun... 

【文章來源】：中國科學技術大學安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 緒論
    1.1 細胞治療的發(fā)展
        1.1.1 干細胞治療
        1.1.2 CIK細胞治療
        1.1.3 NK細胞治療
        1.1.4 T細胞治療
            1.1.4.1 腫瘤浸潤T細胞
            1.1.4.2 TCR-T細胞
    1.2 CAR-T細胞治療
        1.2.1 CAR-T細胞的研究現(xiàn)狀
            1.2.1.1 CD28與4-1BB共刺激的比較
            1.2.1.2 第一代CAR-T
            1.2.1.3 第二代CAR-T
            1.2.1.4 第三代CAR-T
            1.2.1.5 第四代CAR-T
        1.2.2 CAR-T治療血液瘤
        1.2.3 CAR-T治療實體瘤
            1.2.3.1 CAR-T治療實體瘤的現(xiàn)狀
            1.2.3.2 CAR-T治療實體瘤面臨的挑戰(zhàn)
    1.3 肺癌
        1.3.1 導致肺癌的原因
            1.3.1.1 吸煙
            1.3.1.2 氡氣
            1.3.1.3 石棉
            1.3.1.4 空氣污染
            1.3.1.5 遺傳因素
        1.3.2 肺癌的診斷
            1.3.2.1 胸部X光檢查
            1.3.2.2 電子計算機體層掃描（CT）
            1.3.2.3 核磁共振（MRI）
            1.3.2.4 痰脫落細胞的檢查
            1.3.2.5 纖維支氣管檢查（纖支鏡）
            1.3.2.6 開胸手術檢查
            1.3.2.7 其他檢查
        1.3.3 肺癌分類
        1.3.4 肺癌相關的基因突變
            1.3.4.1 RAS
            1.3.4.2 MYC
            1.3.4.3 BCL-2
            1.3.4.4 NOTCH-3
            1.3.4.5 AIS
        1.3.5 目前肺癌的治療方法
            1.3.5.1 手術
            1.3.5.2 放療
            1.3.5.3 化療
            1.3.5.4 靶向抗體治療
        1.3.6 肺癌和LunX
        1.3.7 目前針對于肺癌的CAR-T細胞治療
第二章 引言
第三章 實驗材料與方法
    3.1 實驗動物
    3.2 實驗材料
        3.2.1 小鼠實驗試劑
        3.2.2 人外周血分離相關試劑
        3.2.3 T細胞分離以及活化相關試劑
        3.2.4 細胞系
        3.2.5 細胞培養(yǎng)相關試劑
        3.2.6 流式細胞術相關試劑
        3.2.7 細胞增殖檢測相關試劑
        3.2.8 提取RNA以及逆轉(zhuǎn)錄PCR相關試劑
        3.2.9 分子克隆技術相關試劑
        3.2.10 轉(zhuǎn)染以及包裝濃縮病毒相關試劑
        3.2.11 免疫熒光相關試劑
        3.2.12 蛋白質(zhì)分子生物學相關試劑
        3.2.13 免疫組化相關試劑
        3.2.14 ELISA相關試劑
    3.3 實驗器材
        3.3.1 通用實驗器材
        3.3.2 細胞培養(yǎng)實驗器材
        3.3.3 分子克隆實驗器材
        3.3.4 Western blot實驗器材
        3.3.5 動物實驗實驗器材
        3.3.6 流式細胞術相關器材
        3.3.7 免疫組織化學相關器材
    3.4 實驗方法
        3.4.1 細胞分離,復蘇,培養(yǎng)和凍存
            3.4.1.1 人外周血T細胞分離
            3.4.1.2 人外周血T細胞培養(yǎng)與活化
            3.4.1.3 細胞系的復蘇
            3.4.1.4 貼壁細胞的培養(yǎng)
            3.4.1.5 細胞凍存
            3.4.1.6 Cell trace violet標記細胞
        3.4.2 質(zhì)粒的提取
        3.4.3 RNA的提取
        3.4.4 逆轉(zhuǎn)錄
        3.4.5 PCR
        3.4.6 感受態(tài)轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選
        3.4.7 慢病毒的包裝、收集以及濃縮
        3.4.8 T細胞的活化以及慢病毒的感染
        3.4.9 Western Blotting
        3.4.10 免疫組化
        3.4.11 RTCA檢測殺傷
        3.4.12 流式細胞術
        3.4.13 免疫熒光
        3.4.14 細胞因子的檢測
        3.4.15 小鼠模型構建
        3.4.16 提取小鼠基因組DNA
        3.4.17 抗體的制備與純化
            3.4.17.1 收集雜交瘤細胞培養(yǎng)上清
            3.4.17.2 制備腹水
            3.4.17.3 純化抗體
        3.4.18 統(tǒng)計分析
第四章 實驗結果
    4.1 實驗結果
LunX表達載體">        4.1.1 構建CAR^LunX表達載體
LunXT細胞">        4.1.2 慢病毒成功感染CAR^LunXT細胞
LunXT細胞產(chǎn)生細胞因子">        4.1.3 LunX抗原可以刺激CAR^LunXT細胞產(chǎn)生細胞因子
        4.1.4 非小細胞肺癌細胞膜表達LunX蛋白
LunXT細胞可以靶向殺傷非小細胞肺癌細胞">        4.1.5 CAR^LunXT細胞可以靶向殺傷非小細胞肺癌細胞
+細胞可以特異性活化CAR^LunXT細胞效應功能">        4.1.6 LunX⁺細胞可以特異性活化CAR^LunXT細胞效應功能
LunXT細胞抑制肺癌的生長">        4.1.7 CAR^LunXT細胞抑制肺癌的生長
LunXT細胞抑制PDX模型腫瘤的生長">        4.1.8 CAR^LunXT細胞抑制PDX模型腫瘤的生長
    4.2 總結與討論
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文與取得的其它研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Chimeric antigen receptor-modified T cells for the immunotherapy of patients with EGFR-expressing advanced relapsed/refractory non-small cell lung cancer[J]. Kaichao Feng,Yelei Guo,Hanren Dai,Yao Wang,Xiang Li,Hejin Jia,Weidong Han.  Science China（Life Sciences）. 2016(05)



本文編號：3158796