發(fā)布時間：2017-04-18 18:16

  本文關鍵詞：IL-27、Th1及Th17細胞在MS中的表達及其作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis, MS)是一種自身免疫性疾病,病理特點為炎性侵潤的淋巴細胞和巨噬細胞造成中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘,該病的病變部位位于腦或脊髓。根據臨床病程不同,主要分為復發(fā)緩解型MS(RR-MS)、原發(fā)進展型MS(PP-MS)繼發(fā)進展型MS(SP-M S)等臨床亞型。其中約85%的患者為復發(fā)緩解型,這其中30%-40%的患者于5-8年內進展為繼發(fā)進展型；另外10%～15%的患者為原發(fā)進展型。多發(fā)性硬化的臨床癥狀是由于中樞神經系統(tǒng)髓鞘脫失所造成。但是MS病因和發(fā)病機制至今仍未完全明確,有研究表明,多發(fā)性硬化的發(fā)病原因是因為自身免疫性T淋巴細胞進入中樞神經系統(tǒng),而疾病的進展可能與免疫調節(jié)失衡有關；另外一個有關因素是異位的腦膜B細胞,B細胞異常活化,釋放細胞因子,吸引免疫細胞在中樞神經系統(tǒng)聚集,并引發(fā)皮層脫髓鞘以及軸突和神經元的損傷,最終導致多發(fā)性硬化。二十世紀中期,人們通過對自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的研究,發(fā)現Thl、Thl7細胞和抗原提呈細胞對中樞神經系統(tǒng)損傷；中樞神經系統(tǒng)自身抗原的主動免疫和髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein, MBP)特異性T細胞的被動轉移誘導了EAE的產生。近來的研究進一步證明MS的發(fā)病機制遠比想象的要復雜：眾所周知,Ⅰ型輔助性T細胞(Thl)起重要作用,但其他免疫細胞(包括B細胞、CD8+T細胞和自然殺傷性T細胞等)也能通過誘導或調控MS患者中樞神經系統(tǒng)內的免疫應答過程而參與其發(fā)病過程。白介素-27(interleukin-27, IL-27)于2002年發(fā)現,是IL-12家族的一種細胞因子,由EB病毒誘導蛋白3(EBV induced protein 3, EB3)和P28兩個亞基組成異源二聚體。IL-27不但對早期Th1細胞分化起作用,而且還可以抑制Th1, Th2和Th17細胞的免疫應答；在T細胞增殖分化早期,IL-27促進CD4+T細胞向Thl方向分化,另外IL-27可協(xié)同IL-2促進初始T細胞產生IFN--γ,同時促進單核細胞產生IL-1、12、18和INF-γ等炎癥細胞因子：IL-27還可以抑制輔助性Th17細胞和誘導型調節(jié)性T細胞的發(fā)育；IL-27可誘導小鼠B細胞產生IgG2a,抑制IL-4誘導的IgG1的合成。通過對EAE的研究,證實IL-27通過抑制Th17細胞的反應而對中樞神經系統(tǒng)起到保護作用,最近的研究表明,IL-27可能通過誘導調節(jié)性T細胞產生IL-10發(fā)揮調節(jié)作用,IL-27可通過STAT1信號轉導途徑抑制Thl 7細胞分化,從而達到抑制炎癥的作用。此外,IL-27也可抑制調節(jié)性T細胞的分化增殖,直接減少細胞因子IL-12、IL-17、IL-23等分泌。研究證實：在風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、特發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia, ITP)等自身免疫性疾病中,往往可以發(fā)現IL-27的表達水平下調,故IL-27在自身免疫性疾病的發(fā)病及進展過程中發(fā)揮著重要作用。Thl7細胞是最近發(fā)現的細胞譜系,Th17細胞能分泌炎性介質IL-17,在自身免疫性疾病發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用。之前人們認為EAE是由IL-12誘導的Thl細胞所介導的。通過阻斷IL-12通路,可以明顯改善EAE的癥狀。IL-12是一個包含p40和p35兩個亞單位的異二聚體,研究發(fā)現IL-12p35缺陷的小鼠對EAE發(fā)病是敏感的,而IL-12p40缺陷的小鼠對發(fā)病產生抵抗。IL-23與IL-12共享IL-12p40亞單位,獨立擁有p19亞單位。研究發(fā)現IL-23p19及IL-12p40兩個亞單位可以誘導EAE發(fā)病,而IL-12p35難以誘導EAE發(fā)病。在研究IL-23在EAE和CIA作用機制過程中,發(fā)現缺乏IL-23將無法誘導Thl7細胞分化增殖。相關報道證實：在多發(fā)性硬化患者大腦病灶IL-17 mRNA表達是增加的；和正常腦白質相比,Th17細胞促進因子RORc, IL-17D, IL-26, IL-12R表達增加,而Th17細胞抑制因子IL-4, IFN-γ, IL-10, IL-5 和 IL-13表達減少；早期研究還發(fā)現,多發(fā)性硬化患者血液和腦脊液單核細胞IL-17基因表達較健康對照組高,而且進展型多發(fā)性硬化患者進展期的IL-17基因表達IL-17基因表達更高。在組織中,Thl7細胞刺激生成各種炎性細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶以及其它炎性介質,促進炎性細胞及T細胞聚集；最近一項研究報道,進展型多發(fā)性硬化患者外周血單個核細胞中Thl7細胞的比例是健康對照組的7倍。所有這些都說明Thl7細胞在多發(fā)性硬化發(fā)病過程中起重要作用。Thl7細胞在分化上不同于Thl和Th2細胞。初始CD4+T細胞在IFN-γ的誘導下分化為Thl細胞,在IL-4的誘導下分化為Th2細胞。研究顯示初始CD4+T細胞在轉化生長因子13和IL-6的共同誘導下分化為Thl7細胞,IL-21作為自分泌因子則促進Th17細胞的分化。我們知道,CD4+T細胞的分化需要特殊轉錄因子的參與,Thl細胞的分化需要轉錄因子STAT1、STAT4、T-bet,而Th2細胞需要STAT6等,已發(fā)現一些轉錄因子在Thl7細胞分化中發(fā)揮作用,比如維甲酸相關孤核受體γt(retinoicacid-related orphan nuclear receptoryt, RORyt),與人類Th17細胞表達的特異性轉錄因子RORC同源,是控制Th17細胞分化的關鍵的轉錄因子。它能轉導小鼠初始T細胞誘導IL-17生產發(fā)揮致炎作用。由于TGF-13和IL-6刺激CD4+Th細胞表達RORγt。RORγt缺乏小鼠通過減少IL-17的分泌,減少細胞毒性作用,但是在人類最近的研究報道,雖然TGF-β促進RORC表達,但TGF-β不能誘導Th-17細胞分化,表明人類RORC和IL-17的表達無直接關系。白介素-17是Thl7細胞最主要的效應性細胞因子。IL-17通常指IL-17A,是IL-17家族中的一員。IL-17家族包括6個成員的配體(IL-17A～IL-17F)。報道顯示：對進展型多發(fā)性硬化患者腦活檢,顯示活動性疾病患者較靜止期患者活化Th17細胞增加,IL-17分泌增多,表明IL-17在炎癥反應中起重要作用,而且白介素-17在其它自身免疫性疾病的發(fā)病機制中也起一定的作用,被認為是致病因素之一。比如在風濕性關節(jié)炎,特發(fā)性免疫性血小板減少癥中,IL-17都發(fā)揮著它的致病作用。IL-17不僅誘導CCL2、IL-6和IL-8的分泌,還可以觸發(fā)血腦屏障內皮細胞形成活化產物；這些活化產物進一步誘導小膠質細胞分泌IL-6、CXCL2,誘導少突膠質細胞分泌IL-6,IL-1和一氧化氮等炎性產物,誘導中性粒細胞聚集,增強炎癥反應；IL-17通可收縮血腦屏障內皮細胞,中斷緊密連接蛋白的表達,介導其它炎性因子通過血腦屏障,造成神經損傷；IL-17協(xié)同TNF-α作用,增強不同的上皮和內皮細胞分泌P-選擇素、E-選擇素、CXCL1、CXCL2、CXCL5、 GM-CSF 和 G-CSF,增加氧化應激誘導少突膠質細胞凋亡。IL-17是MS動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎EAE的重要效應因子,實驗證實：將EAE小鼠IL-17基因敲除,所造成的EAE神經損傷程度降低；且給予抗IL-17中和性抗體注射,可以降低甚至延緩EAE的發(fā)生。由此一種新觀點認為,在EAE中起核心作用的是IL-17誘導產生的以分泌IL-17、IL-17F、IL-6等促炎癥細胞因子為特征的Th17細胞。作為自身免疫性疾病中的一種,多發(fā)性硬化呈現T細胞亞群失衡,造成免疫反應損傷神經,IL-27與Th1、Th17細胞分化增殖密切相關,所以我們對IL-27與MS中T細胞亞群失衡進行相關性的研究。通過測定進展型MS患者及健康對照血漿IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-27水平、外周血Th1、Th17細胞亞群表達水平,來探討IL-27在進展型MS患者中Th1、Th17細胞失衡的作用機制。目的：檢測進展型MS病人及健康對照血漿IL-27,FN-γ, IL-17表達水平：檢測外周血單核細胞IL-27,IFN-γ,T-bet,IL-17, RORγtmRNA表達及Th1、Th17細胞的表達情況,分析IL-27和血漿IFN-γ,IL-17及與外周血Th1、Th17細胞的表達相關性,探討IL-27在多發(fā)性硬化Th細胞亞群失衡中的作用機制,進一步闡明IL-27在多發(fā)性硬化的發(fā)病中的作用,為進展型MS診斷和治療提供幫助。材料和方法：(1)抽取45例MS患者及25例健康對照外周血,肝素抗凝,離心,留取血漿,于-80。C低溫冰箱保存。(2)Ficoll-Paque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)(3)收集病人及健康對照血漿,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELIS A)檢測MS及健康對照血漿中IL-27,IFN-γ和IL-17的水平。(4)全血抗凝,加入PMA,莫能霉素及離子霉素的刺激液,進行流式細胞儀染色法測定外周血淋巴細胞IL-17和IFN-y的表達,從而檢測外周血中Th17以及Thl細胞的表達情況。(5)實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測外周血IL-27,IFN-γ, T-bet, IL-17和RORytmRNA表達水平。結果：(1)ELISA結果顯示：MS患者血漿IL-27水平(119.16±29.86 pg/ml)顯著低于健康對照血漿IL-27水平(140.01±15.23 pg/mL,P0.05)；MS患者血漿IFN-γ水平(143.05 ± 7.13pg/mL)與健康對照組血漿IFN-γ水平(40.02±5.72pg/ml)無顯著差異(P=0.074,)；MS患者血漿IL-17水平(33.68±9.07 pg/ml)顯著高于健康對照血漿IL-17水平(20.17±4.97 pg/mL, P0.001,);血漿IL-27水平在繼發(fā)進展型MS患者(117.5±31.36 pg/mI)、原發(fā)進展型MS患者(122.16±27.66 pg/ml)二組間無顯著差異(P=0.564,):血漿IFN-y水平在繼發(fā)進展型MS患者(42.99±7.18 pg/ml)、原發(fā)進展型MS患者(43.13±7.26pg/ml)二組間無顯著差異(P=0.949；)；血漿IL-17水平在繼發(fā)進展型MS患者(34.39±8.26pg/ml)、原發(fā)進展型MS患者(32.40±10.56 pg/ml)二組間無顯著差異(P=0.42；)。(2)MS患者血漿IL-27水平與IL-17水平之間存在負相關(r=-0.371,P=0.012,Pearson correlation analysis)；MS患者血漿IL-27水平與IFN-γ水平之間無相關性(r-0.07,P=0.649),Spearman correlation analysis)。(3)進展型MS患者Thl細胞的水平略高于健康對照組(11.54±3.38% vs.06±3.04%),但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.075)；和進展型MS患者血漿IL-17水平升高一致,Th17細胞水平顯著高于健康對照組(2.01±0.58% vs.1.33±0.36%；P0.001)；Thl細胞的水平在繼發(fā)進展型MS病人和原發(fā)進展型MS病人之間沒有顯著差異(11.70±3.46% vs.11±3.32%,P=0.662)。同樣的,Th17細胞的水平在繼發(fā)進展型MS病人和原發(fā)進展型MS病人之間沒有顯著差異(2.02±0.56% vs.1.99±0.63,P=0.82)。(4)進展型MS患者血漿中的IL-27水平與其相應外周血中的Th17細胞表達水平之間呈負相關性(r=-0.301,P=0.045)。而且,MS患者血漿中的IL-27水平與其相應外周血中的Thl細胞表達水平之間未發(fā)現相關性(r=0.164,P=0.281)。(5)RT-PCR結果示：進展型MS患者外周血單核細胞IL-27mRNA水平顯著低于健康對照(0.69-fold,P0.001)；進展型MS患者外周血單核細胞IFN-y,T-bet水平與正常對照組之間無顯著差異(P0.05).；進展型MS患者外周血單核細胞IL-1 7mRNA水平與RORγtmRNA水平均較健康對照顯著升高(4.39-fold,P0.001；and 9.58-fold,P0.001)。結論：(1)證實IL-27表達異�？赡軈⑴c了MS發(fā)病；(2)在MS病人中,血漿IL-17及特異性轉錄因子RORγtmRNA的表達水平是顯著升高,并且與Th 17細胞在MS中表達升高呈現一致性：表明MS病人Thl7細胞表達異常。(3)進展性MS患者的IL-27與血漿IL-17濃度及外周血Th17細胞表達呈負相關,提示IL-27在MS中的具有抗炎保護作用,表明IL-27可能成為MS診斷和治療的一種新策略。意義：本研究發(fā)現進展型MS患者血漿IL-27水平和外周血IL-27mRNA表達水平下降,并且IL 17以及Th17細胞表達升高,這表明IL-27、Th17細胞在MS病理生理過程中發(fā)揮作用。此外,進展型MS患者IL-27與Th17細胞表達和血漿IL-17濃度呈負相關。表明IL-27可能對進展型MS診斷和治療提供幫助。
【關鍵詞】：多發(fā)性硬化 Th1細胞 Th17細胞 IL-27 CD4~+T細胞
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R744.51
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 符號說明20-22
• 第Ⅰ部分 白介素-27在多發(fā)性硬化中的表達及其作用機制研究22-40
• 前言22-25
• 材料與方法25-30
• 結果30-31
• 討論31-33
• 結論33-34
• 附圖表34-37
• 參考文獻37-40
• 第Ⅱ部分 Th1細胞與Th17細胞在多發(fā)性硬化中的表達及其作用機制研究40-66
• 前言40-43
• 材料與方法43-49
• 結果49-51
• 討論51-54
• 結論54-55
• 附圖表55-61
• 參考文獻61-66
• 第Ⅲ部分 IL-27在多發(fā)性硬化Th亞群失衡中的作用機制研究66-96
• 前言66-68
• 材料與方法68-74
• 結果74-77
• 討論77-80
• 結論80-81
• 附圖表81-89
• 參考文獻89-96
• 致謝96-97
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文97-98
• 英文正文I98-121
• 英文正文Ⅱ121-136
• 英文正文Ⅲ136-150
• 附件150

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本文編號：315480