本文關(guān)鍵詞：MACC1基因表達對非小細胞肺癌血管生成的影響及相關(guān)機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：研究MACC1、c-Met、微血管密度(Microvascular density, MVD)在NSCLC中的表達及相關(guān)性,探討三者與NSCLC臨床病理特征(特別是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管生成)之間的關(guān)系；并進一步通過雞胚尿囊膜實驗和NSCLC細胞實驗研究MACC1基因?qū)SCLC血管生成的影響及相關(guān)分子作用機制。方法：1.MACC1、c-Met、MVD在NSCLC中的表達及相關(guān)性研究,探討三者與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系：收集手術(shù)切除后的NSCLC組織50例,采用免疫組織化學方法檢測癌組織和癌旁正常組織中的MACC1、c-Met、MVD (CD34標記)表達情況,分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系及三者的相關(guān)性。2. NSCLC細胞系中MACC1的mRNA水平的測定：培養(yǎng)5株NSCLC細胞,采用實時熒光定量PCR (RT-qPCR)方法檢測MACC1基因在所培養(yǎng)的5株NSCLC細胞中的相對表達水平；3.沉默MACC1基因表達對NSCLC細胞促血管生成的影響及其作用機制研究：選擇MACC1基因高表達肺癌細胞系XWLC-05,使用化學合成的MACC1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染XWLC-05細胞,經(jīng)相關(guān)檢測有效沉默細胞中MACC1基因表達的基礎(chǔ)上,分別于轉(zhuǎn)染細胞0小時,24小時,48小時,72小時后收集培養(yǎng)細胞上清液,采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中血管生成相關(guān)因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于轉(zhuǎn)染72小時后收集各實驗組細胞上清液,通過雞胚尿囊膜實驗檢測各實驗組血管生成情況,同時提取各實驗組細胞總蛋白,Western-blot方法檢測MACC1下游信號通路關(guān)鍵蛋白分子Met、p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相對表達量。4.MACC1基因過表達對非小細胞肺癌促血管生成的影響及其作用機制研究：搜索Genebank中人MACC1的基因序列,自Thermo Scientific公司購買MACC1 cDNA克隆質(zhì)粒進行擴增,經(jīng)雙酶切后將目的基因MACC1序列克隆入帶有綠色熒光蛋白報告基因的PIRES2-EGFP表達載體,經(jīng)測序檢測成功構(gòu)建PIRES2-EGFP-MACC1表達質(zhì)粒,將已構(gòu)建成功的PIRES2-EGFP-MACC1表達載體瞬時轉(zhuǎn)染人MACC1基因低表達肺腺癌細胞系SPC-A1,分別于轉(zhuǎn)染細胞0小時,24小時,48小時,72小時后收集培養(yǎng)細胞上清液,采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中血管生成相關(guān)因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于轉(zhuǎn)染72小時后收集各實驗組細胞上清液,通過雞胚尿囊膜實驗檢測各實驗組血管生成情況,同時提取各實驗組細胞總蛋白,Western-blot方法檢測MACC1下游信號通路關(guān)鍵蛋白分子Met、 p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相對表達量。結(jié)果：1.50例NSCLC組織中MACC1、c-Met陽性表達率分別為68%、64%,與相應(yīng)癌旁正常組織陽性表達率(32%,36%)相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); MACC1、c-Met陽性表達在NSCLC組織中表達呈正相關(guān),與NSCLC的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；NSCLC組織中MACC1、 c-Met陽性組MVD值高于MACC1、c-Met陰性的肺癌組織(P0.05),相關(guān)性分析得出MACC1、c-Met的表達與MVD值存在相關(guān)性(P0.05)；2. RT-qPCR顯示五株NSCLC細胞中宣威肺腺癌細胞XWLC-05 MACC1 mRNA表達水平最高,肺腺癌細胞SPC-A1 MACC1 mRNA的表達水平最低；3.化學合成的3組MACC1-siRNA均能沉默XWLC-05細胞中MACC1基因的表達,選擇抑制效率最高的MACC1-siRNA3組應(yīng)用于后續(xù)實驗,其結(jié)果提示：MACC1 siRNA轉(zhuǎn)染XWLC-05細胞后,雞胚尿膜囊實驗顯示MACC1-siRNA干擾組雞胚尿囊膜新生血管面積較無義siRNA組及空白對照組減少(P0.05)：ELISA檢測結(jié)果顯示于48和72小時所提取細胞培養(yǎng)上清液中的VEGF、bFGF和IL-8細胞因子的表達水平明顯被抑制(P0.05)；Western-blot檢測結(jié)果顯示NSCLC細胞中的Met、p-MEK和p-ERK表達水平顯著降低(P0.05),但總MEK和ERK蛋白表達無明顯差異,AKT及其磷酸化蛋白水平均未受影響。4.成功構(gòu)建PIRES2-EGFP-MACC1表達載體,經(jīng)測序鑒定序列完全正確,轉(zhuǎn)染SPC-A1細胞后熒光顯微鏡下可見清晰的綠色熒光表達,RT-PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1的SPC-A1細胞能夠穩(wěn)定表達MACC1 mRNA,與轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP (Vector)組和空白對照組相比,轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1組SPC-A1細胞MACC1 mRNA的表達量明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。雞胚尿膜囊實驗顯示轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1組可見稍多的血管分支,雞胚尿囊膜新生血管面積較PIRES2-EGFP (Vector)組及空白對照組相比增多,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)；Western-Blot檢測結(jié)果顯示PIRES2-EGFP-MACC1轉(zhuǎn)染組SPC-A1細胞c-Met表達水平顯著增加,MAPK信號通路的關(guān)鍵蛋白因子p-MEK和p-Erk略有增加(P0.05),總MEK和Erk蛋白量沒有變化,而AKT及其磷酸化水平蛋白未受影響,ELISA結(jié)果顯示與PIRES2-EGFP (Vector)組及空白對照組相比,轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1組SPC-A1細胞上清液中血管生成相關(guān)因子VEGF, bFGF和IL8的分泌水平在24小時時基本一致,但48h和72小時后上述三個因子的表達水平明顯增長(P0.05)。結(jié)論：1.NSCLC組織中MACC1、c-Met在NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能起重要作用,結(jié)合臨床分期對非小細胞肺癌患者病情評估及預(yù)后判斷有一定的指導意義。2. NSCLC組織中MACC1、c-Met的表達與MVD值存在相關(guān)性,說明MACC1、c-Met的表達可能與NSCLC的血管生成有關(guān)。3.MACC1基因能夠影響NSCLC細胞誘導雞胚尿膜囊微血管形成的能力,其機制可能與MACC1通過影響NSCLC細胞中的HGF/c-Met及其下游MEK/ERK信號通路,調(diào)控細胞中血管生成相關(guān)因子VEGF、bFGF和IL8等分泌有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 非小細胞肺癌 雞胚尿膜囊實驗 小干擾RNA MEK/ErkAKT 細胞因子
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 英文縮寫詞表(按照英文單詞字母順序排列)7-9
• 研究背景9-17
• 研究的意義9
• 國內(nèi)外研究進展9-13
• 存在的問題13-14
• 參考文獻14-17
• 技術(shù)路線圖17-18
• 全文中文摘要18-21
• Abstract21-25
• 第一部分 ：MACC1在非小細胞肺癌臨床組織樣本和相關(guān)肺癌細胞中的表達情況25-52
• 中文摘要25-27
• ABSTRACT27-29
• 前言29-30
• 材料與方法30-38
• 結(jié)果38-44
• 討論44-49
• 參考文獻49-52
• 第二部分 siRNA沉默MACC1基因表達對人肺癌細胞促進血管形成的影響52-85
• 中文摘要52-54
• ABSTRACT54-56
• 前言56-57
• 材料與方法57-69
• 結(jié)果69-74
• 討論74-80
• 參考文獻80-85
• 第三部分 過表達MACC1基因?qū)θ薔SCLC細胞促血管生成的影響85-124
• 中文摘要85-87
• ABSTRACT87-89
• 前言89
• 材料與方法89-105
• 結(jié)果105-117
• 討論117-122
• 參考文獻122-124
• 全文總結(jié)124-126
• 綜述126-137
• 參考文獻133-137
• 關(guān)于使用組織樣本開展科學研究的知情同意書137-139
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文139-140
• 致謝140-141

【參考文獻】

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：312440