多發(fā)性骨髓瘤（MM）的疾病特點為是骨髓漿細胞在低氧骨髓微環(huán)境中惡性增殖,其具有高度異質(zhì)的遺傳背景和臨床表現(xiàn),預后差。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類不編碼蛋白,長度大于200nt的RNA分子。lncRNA可參與染色質(zhì)修飾,轉(zhuǎn)錄激活,核內(nèi)運輸?shù)榷喾N生理過程。既往研究報道,低氧相關的lncRNA可參與缺氧/HIF-1相關的癌癥進展。低氧微環(huán)境對MM的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及復發(fā)至關重要,所以我們使用RNA高通量測序分析在低氧培養(yǎng)條件下,骨髓瘤細胞系U266內(nèi)差異表達的lncRNA分子。我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α可促進骨髓瘤細胞系內(nèi)lncRNA DARS-AS1的轉(zhuǎn)錄。體內(nèi)及體外實驗均證明,DARS-AS1過表達可促進骨髓瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡,敲除DARS-AS1可抑制骨髓瘤細胞增殖并促進其凋亡。通過RNA-Pulldown聯(lián)合蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的方法,我們檢測到RBM39為DARS-AS1的靶蛋白。過表達RBM39可以部分恢復敲除DARS-AS1后的細胞表型。我們推斷DARS-AS1可能通過影響RBM39的表達水平而發(fā)揮其生物學功能。進一步研究表明,DARS-AS1可以減弱RBM39與E3泛素連... 

【文章來源】：上海交通大學上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

長鏈非編碼RNA的作用機制

上海交通大學醫(yī)學院博士學位論文22在分析細胞轉(zhuǎn)錄組及其表達水平中的應用十分廣泛。我們利用此技術對U266細胞的轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序，來尋找受低氧調(diào)控的lncRNA。得到相關的數(shù)據(jù)后，我們進行下一步的驗證，首先要設置的篩選條件是RPKM值大于10，即lncRNA在細胞中的表達要易于檢測。調(diào)變的lncRNA，我們設置的篩選條件是差異倍數(shù)大于4（低氧/常氧≥4或者低氧/常氧0.25）。符合以上兩個條件的lncRNA共有77個。然后，從上述調(diào)變的lncRNA對其設計qRT-PCR引物并進行驗證。其中有30個lncRNA可以qRT-PCR引物設計，并從引物的熔解曲線、PCR的擴增曲線以及PCR產(chǎn)物的特異性三個方面對檢測效率進行了評估，最終我們成功鑒定了22個lncRNA（見圖1）。具體鑒定方法如下：將1106個U266細胞系置于低氧環(huán)境中（氧濃度1%）放置24小時，同時設置常氧下培養(yǎng)的U266細胞系作為對照。提取U266細胞中RNA，使用Q-PCR的方法對lncRNA的表達差異進行檢測。結(jié)果提示MIR210HG與DARS-AS1在低氧培養(yǎng)條件下，明顯升高。圖1.U266細胞內(nèi)的lncRNAs的鑒定Figure1.InvivoidentificationoflncRNAsinU266cellline2.2表達調(diào)變的lncRNA的生物學功能篩選簡述一下功能篩選的方法。首先，針對lncRNA設計shRNA片段，將其轉(zhuǎn)染到MM細胞系中，然后利用qRT-PCR檢測其敲減效率。因為低氧環(huán)境對骨髓瘤的增殖、凋亡影響較多，因此，我們選擇細胞增殖及凋亡實驗作為主要的功能篩選實驗。

上海交通大學醫(yī)學院博士學位論文23MIR210HGshRNA敲除效率如圖2A，可見shRNA敲除效率可達50%以上。但敲除MIR210HG對細胞的增殖及凋亡無明顯影響（圖2B-D）圖2.lncRNAMIR210HG的生物學功能驗證Figure2.BiologicalfunctionalstudyoflncRNAMIR210HG（A）qRT-PCR檢測MIR210HG在骨髓瘤細胞中的敲除效率。（B-C）MIR210HG敲除后，CCK-8檢測細胞增殖速率檢測。（D）AnnexinV/PI雙染細胞后，使用流式細胞技術檢測細胞凋亡。我們檢測了DARS-AS1在多種MM細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)多種骨髓瘤細胞系中DARS-AS1均可以在低氧培養(yǎng)條件下高表達（如圖3A）。同時將正常供者的單個核細胞與MM患者骨髓內(nèi)CD138+的漿細胞同時放置在低氧環(huán)境（1%低氧）中，處理24h。骨髓瘤患者CD138+的漿細胞內(nèi)的DARS-AS1升高倍數(shù)明顯高于正常供者（如圖3B）。


本文編號：3103393