多發(fā)性骨髓瘤（MM）的疾病特點(diǎn)為是骨髓漿細(xì)胞在低氧骨髓微環(huán)境中惡性增殖,其具有高度異質(zhì)的遺傳背景和臨床表現(xiàn),預(yù)后差。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類不編碼蛋白,長度大于200nt的RNA分子。lncRNA可參與染色質(zhì)修飾,轉(zhuǎn)錄激活,核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N生理過程。既往研究報(bào)道,低氧相關(guān)的lncRNA可參與缺氧/HIF-1相關(guān)的癌癥進(jìn)展。低氧微環(huán)境對MM的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及復(fù)發(fā)至關(guān)重要,所以我們使用RNA高通量測序分析在低氧培養(yǎng)條件下,骨髓瘤細(xì)胞系U266內(nèi)差異表達(dá)的lncRNA分子。我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α可促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞系內(nèi)lncRNA DARS-AS1的轉(zhuǎn)錄。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證明,DARS-AS1過表達(dá)可促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡,敲除DARS-AS1可抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。通過RNA-Pulldown聯(lián)合蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的方法,我們檢測到RBM39為DARS-AS1的靶蛋白。過表達(dá)RBM39可以部分恢復(fù)敲除DARS-AS1后的細(xì)胞表型。我們推斷DARS-AS1可能通過影響RBM39的表達(dá)水平而發(fā)揮其生物學(xué)功能。進(jìn)一步研究表明,DARS-AS1可以減弱RBM39與E3泛素連... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

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長鏈非編碼RNA的作用機(jī)制

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文22在分析細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及其表達(dá)水平中的應(yīng)用十分廣泛。我們利用此技術(shù)對U266細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，來尋找受低氧調(diào)控的lncRNA。得到相關(guān)的數(shù)據(jù)后，我們進(jìn)行下一步的驗(yàn)證，首先要設(shè)置的篩選條件是RPKM值大于10，即lncRNA在細(xì)胞中的表達(dá)要易于檢測。調(diào)變的lncRNA，我們設(shè)置的篩選條件是差異倍數(shù)大于4（低氧/常氧≥4或者低氧/常氧0.25）。符合以上兩個(gè)條件的lncRNA共有77個(gè)。然后，從上述調(diào)變的lncRNA對其設(shè)計(jì)qRT-PCR引物并進(jìn)行驗(yàn)證。其中有30個(gè)lncRNA可以qRT-PCR引物設(shè)計(jì)，并從引物的熔解曲線、PCR的擴(kuò)增曲線以及PCR產(chǎn)物的特異性三個(gè)方面對檢測效率進(jìn)行了評估，最終我們成功鑒定了22個(gè)lncRNA（見圖1）。具體鑒定方法如下：將1106個(gè)U266細(xì)胞系置于低氧環(huán)境中（氧濃度1%）放置24小時(shí)，同時(shí)設(shè)置常氧下培養(yǎng)的U266細(xì)胞系作為對照。提取U266細(xì)胞中RNA，使用Q-PCR的方法對lncRNA的表達(dá)差異進(jìn)行檢測。結(jié)果提示MIR210HG與DARS-AS1在低氧培養(yǎng)條件下，明顯升高。圖1.U266細(xì)胞內(nèi)的lncRNAs的鑒定Figure1.InvivoidentificationoflncRNAsinU266cellline2.2表達(dá)調(diào)變的lncRNA的生物學(xué)功能篩選簡述一下功能篩選的方法。首先，針對lncRNA設(shè)計(jì)shRNA片段，將其轉(zhuǎn)染到MM細(xì)胞系中，然后利用qRT-PCR檢測其敲減效率。因?yàn)榈脱醐h(huán)境對骨髓瘤的增殖、凋亡影響較多，因此，我們選擇細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)作為主要的功能篩選實(shí)驗(yàn)。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文23MIR210HGshRNA敲除效率如圖2A，可見shRNA敲除效率可達(dá)50%以上。但敲除MIR210HG對細(xì)胞的增殖及凋亡無明顯影響（圖2B-D）圖2.lncRNAMIR210HG的生物學(xué)功能驗(yàn)證Figure2.BiologicalfunctionalstudyoflncRNAMIR210HG（A）qRT-PCR檢測MIR210HG在骨髓瘤細(xì)胞中的敲除效率。（B-C）MIR210HG敲除后，CCK-8檢測細(xì)胞增殖速率檢測。（D）AnnexinV/PI雙染細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。我們檢測了DARS-AS1在多種MM細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多種骨髓瘤細(xì)胞系中DARS-AS1均可以在低氧培養(yǎng)條件下高表達(dá)（如圖3A）。同時(shí)將正常供者的單個(gè)核細(xì)胞與MM患者骨髓內(nèi)CD138+的漿細(xì)胞同時(shí)放置在低氧環(huán)境（1%低氧）中，處理24h。骨髓瘤患者CD138+的漿細(xì)胞內(nèi)的DARS-AS1升高倍數(shù)明顯高于正常供者（如圖3B）。


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