[目 的]癌胚抗原相關(guān)粘附分子1（CEACAM1）表達(dá)于血小板膜上,起負(fù)性調(diào)節(jié)血小板膠原受體糖蛋白Ⅵ（GPVI）的作用。CEACAM1胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIMs）可以抑制GPVI-FcRγ鏈復(fù)合物中FcRγ胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAMs）介導(dǎo)的血小板活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),但迄今對(duì)CEACAM1胞外段結(jié)構(gòu)域在血小板功能調(diào)控中的作用仍知之甚少。前期研究提示:膠原刺激血小板釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶-12（MMP-12）可以酶切血小板膜蛋白CEACAM1胞外段結(jié)構(gòu)域,CEACAM1被酶切后其抑制功能可能受損,導(dǎo)致膠原活化血小板的效應(yīng)增強(qiáng)。但CEACAM1胞外段的可溶性酶切片段對(duì)血小板功能的影響尚不明確,其作用機(jī)制也有待進(jìn)一步探討。為此,我們研究了CEACAM1胞外段結(jié)構(gòu)域及可溶性酶切片段對(duì)血小板功能的影響,并且對(duì)相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了探索。本研究為闡明CEACAM1負(fù)性調(diào)節(jié)血小板活化的機(jī)制、研發(fā)新型抗血小板藥物提供新的思路。[方 法]第一部分:本部分旨在探索CEACAM1胞外段結(jié)構(gòu)域以及可溶性酶切片段對(duì)血小板功能的影響。采用血小板聚集儀觀(guān)察了表達(dá)純化的人CEACAM1胞外段結(jié)構(gòu)域蛋白... 

【文章來(lái)源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖２－１：?ｒｈＣＥＡＣＡＭｌ－ｌ源性多肽對(duì)不Ｍ血小板激活劑誘導(dǎo)的血小板聚Ｉｆｃ的影響

ＡＢＣ??Ｔｈｒｏｍｂｉｎ?０．０５Ｕ／ｍＬ?ＡＤＰ?ＡＡ０．１７Ｍ??８０－ｉ?４０－ｉ?５０－．??＊?ｉＭ－ａｉ??ｎ?＾１１?ｎ??ｔ，?ｌ?，?ｉ?丨?ｉ?ＪｍｍｍＵ??，／?ｙ，?ｗ?，人＜／，??ＱＤＴＴ?ＱＤＴＴ?ＱＤＴＴ??圖２－４：凝血酶、ＡＤＰ、ＡＡ刺激引起的血小板聚集被ＱＤＴＴ抑制??Ｆｉｇｕｒｅ?２－４．?ＱＤＴＴ?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｔｈｒｏｍｂｉｎ，?ＡＤＰ，?ＡＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｐｌａｔｅｌｅｔ?ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．??ＱＤＴＴ?（５〇ｎＭ，?２５０［ｉＭ，５００ｐＭ）在?３７°Ｃ下與洗滌血小板（２００ｘｌ０９／ｍＬ）孵育?１０?分鐘??后，使用低濃度的（Ａ）凝血酶（０．０５Ｕ／ｉｉｉＬ），?（Ｂ）ＡＤＰ?（ｌＯｐＭ），?（Ｃ）ＡＡ?（０．１７Ｍ）誘導(dǎo)血??小板聚集。血小板聚集峰值以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，ｎ＝４。與對(duì)照組（Ｖｅｈｉｃｌｅ）比較，＊ｐ＜??０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，?＊＊，＜０．００１。??４．?ＱＤＴＴ、ＱＬＳＮ對(duì)血小板－膠原粘附作用的影響??血管內(nèi)皮因損傷而暴露內(nèi)皮下基質(zhì)，刺激血小板粘附、活化及聚集，引起止??血和血栓形成。調(diào)節(jié)血小板靜態(tài)粘附的主要膜蛋白有兩個(gè)，他們分別是ＧＰＶＩ和??ｏｔ２ｐｌ，其中ＧＰＶＩ為介導(dǎo)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集和粘附的主要受體，而ｃｃ２ｐｉ主??要參與調(diào)節(jié)血小板的粘附。為進(jìn)一步明確ＣＥＡＣＡＭ１胞外段蛋白及酶切片段對(duì)??血小板活化功能的影響，本研究觀(guān)察了?ｒｈＣＥＡＣＡＭｌ，?ｒｈＣＥＡＣＡＭｌ－１，?ＱＤＴＴ，??ＱＬＳＮ對(duì)血小板靜態(tài)粘附于膠原的影響。不同濃度的ｒｈＣＥＡＣＡＭＫｌＯｎＭ，?１００ｎＭ，??５ｊａＭ）

圖４－１：?ＱＤＴＴ、ＱＬＳＮ以及Ｈｉｓ－ＱＤＴＴ、Ｈｉｓ－ＱＬＳＮ對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?４－１．?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ＱＤＴ１＼?ＱＬＳＮ?ａｎｄ?Ｈｉｓ－ＱＤＴＴ．?Ｈｉｓ－ＱＬＳＮ?ｏｎ?ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ??ｐｌａｔｅｌｅｔ?ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．??ＱＤＴＴ、ＱＬＳＮ?以及?Ｈｉｓ－ＱＤＴＴ、Ｈｉｓ－ＱＬＳＮ?在?３７°Ｃ下與洗滌血小板（２００ｘ１０９／ｍＬ）孵育?１０??分鐘后，使用膠原（２ｎｇ／ｍＬ）誘導(dǎo)血小板聚集。血小板聚集峰值以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，ｎ＝３。??ＮＳ．組間統(tǒng)計(jì)，／？〉０．０５。??我們已經(jīng)通過(guò)血小板聚集率檢測(cè)方法，確定Ｈｉｓ－標(biāo)簽對(duì)ＱＤＴＴ、ＱＬＳＮ的活??性無(wú)明顯影響，因此擬采用ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ的方法將與其互作的蛋白篩選出來(lái)。５００??＿?Ｈｉｓ－ＱＤＴＴ及５０?＿?Ｈｉｓ－ＱＬＳＮ與洗滌人血小板膜蛋白提取液孵育后與Ｎｉ?２＋??－Ａｇａｒｏｓｅ結(jié)合，洗脫物經(jīng)上樣緩沖液處理進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳，凝膠染色??后脫色并拍照。如圖４－２所示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組并未犮現(xiàn)明顯的差兄性條帶。??Ａ?Ｂ??Ｍ?１?２?３?４?Ｍ?１?２?３?４??鎖：１?＇＾１??４０－??２５－鉍??３０－??Ｉ??１０－?２５－??圖４－２：血小板裂解液屮１ｊ?Ｈｉｓ－?ＱＤＴＴ／ＱＬＳＮ相互作用的蛋白的篩選??Ｆｉｇｕｒｅ?４－２．?Ｈｉｓ－ＱＤＴＴ／ＱＬＳＮ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ?ｆｒｏｍ?ｐｌａｔｃｌｅｌ?ｌｙｓａｔｅｓ．??洗滌血小板（２００ｘｌ０９／Ｌ）裂解液與Ｈｉｓ－ＱＤＴＴ、Ｈｉｓ－ＱＬＳＮ或ＤＭＳＯ溶劑對(duì)照于４°Ｃ下孵??育過(guò)


本文編號(hào)：3099023