第一部分:MiR-124通過(guò)STAT3/HIF-1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)多索魯比素的耐藥性目的:探究MiR-124通過(guò)STAT3/HIF-1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)多索魯比素的耐藥性。方法:基于GPL571,使用GSE24460進(jìn)行微陣列分析,以確定乳腺癌干細(xì)胞多藥耐藥基因中mRNA的表達(dá)差異。GSE24460中分為兩組,包括2個(gè)親本對(duì)照組和2個(gè)MCF7細(xì)胞耐藥組。收集MCF7細(xì)胞,并酶解成單細(xì)胞懸液。MicroRNA-124模擬物和非特異性miRNA對(duì)照由GenePharma（中國(guó)上海）合成。STAT3 siRNA和對(duì)照siRNA購(gòu)自賽默飛世爾科技公司（美國(guó)）。pcDNA3.1-STAT3質(zhì)粒來(lái)自GenePharma。使用Lipofectamine TM 2000（Invitrogen Co.,卡爾斯巴德,CA）根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)MTT測(cè)定細(xì)胞活力。含有推定的miR-124結(jié)合位點(diǎn)的STAT3 3’UTR通過(guò)TargetScan（www.targetscan.org）進(jìn)行分析,并將該miRNA位點(diǎn)插入螢光素酶基因（Promega,美國(guó)）的下游并轉(zhuǎn)染,測(cè)定螢光素酶活性。免... 

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【部分圖文】：

STAT3在MCF7-R細(xì)胞中高表達(dá)

STAT3在MCF7和MCF7-R中的表達(dá)

為了證明STAT3對(duì)CD24-CD44+BCSC的抑制作用,將pcDNA3.1-STAT3載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。pcDNA3.1-STAT3載體質(zhì)粒編碼除3"UTR以外在內(nèi)的STAT3結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)編碼序列,并且si-STAT3也被轉(zhuǎn)染用于功能喪失測(cè)定。如圖3A所示,抗阿霉素的CD24-CD44+BCSC顯示出更大的IC50。STAT3的轉(zhuǎn)染進(jìn)一步提高了耐藥性,而si-STAT3降低了耐藥性,使其表達(dá)更接近于正常CD24-CD44+BCSCs。同樣,STAT3增加了MCF7-R細(xì)胞系中CD24-CD44+細(xì)胞的遷移,而si-STAT3則減少了遷移(圖3B)。STAT3的敲低使得細(xì)胞周期停止于G0期,從而阻礙細(xì)胞生長(zhǎng),而過(guò)表達(dá)的STAT3則加速了細(xì)胞周期進(jìn)入S或M期(圖3C,P<0.05)。為了測(cè)試BCSC中STAT3對(duì)阿霉素的抗性,我們使用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)分析來(lái)檢測(cè)STAT3對(duì)BCSC對(duì)阿霉素的抗性的影響。與MCF7-R組相比,si-STAT3組的凋亡率更高,而pc組在兩種阿霉素濃度下均具有相反的結(jié)果。此外,NC組的凋亡率比MCF7組更高(圖3D,P<0.05)。與NC組相比,si-STAT3組的侵襲BCSC數(shù)量減少,而STAT3組則數(shù)量增加(圖3E,P<0.05)。在Western Blot中,我們測(cè)試了包括ALDH1、SOX2和OCT4在內(nèi)的,與腫瘤干細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)的基因。所有基因在pc-STAT3組中的表達(dá)均比MCF7-R組中的更高。si-STAT3組中這些基因的相對(duì)表達(dá)水平低于NC組(圖4A,P<0.05)。然后,我們使用蛋白質(zhì)印跡來(lái)驗(yàn)證STAT3是否會(huì)通過(guò)HIF-1信號(hào)通路影響B(tài)CSC。圖4B顯示,HIF-1α在pc-STAT3組中具有更高的表達(dá),并且HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑被激活(P<0.01)。


本文編號(hào)：3002209