背景:長段周圍神經(jīng)缺損修復(fù)仍是現(xiàn)階段臨床棘手問題,周圍神經(jīng)再生障礙通常會導(dǎo)致長期的部分或全部感覺和/或運(yùn)動障礙。目前周圍神經(jīng)長距離缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)是自體神經(jīng)移植,但這受供體神經(jīng)來源的制約。神經(jīng)導(dǎo)管(neural guidance conduit,NGC)可連接神經(jīng)缺損的近端和遠(yuǎn)端,為軸突再生提供了物理和/或生化線索而成為目前有希望成為替代自體移植的治療方案,導(dǎo)電性聚合物(conducting polymers,CPs)基功能化NGC通過維持電信號通路來增強(qiáng)神經(jīng)再生,但是目前導(dǎo)電性聚合物受到其溶解性差、加工困難等缺點(diǎn)的限制,而難以廣泛應(yīng)用,因此亟需開發(fā)新型外周神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)電性材料以促進(jìn)神經(jīng)再生。目的:本系列研究主要圍繞用于制備NGC的新型導(dǎo)電性材料展開相關(guān)探索。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中選用碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)摻雜的聚己內(nèi)酯(poly(ε-caprolactone),PCL)通過靜電紡絲技術(shù)制作取向度可調(diào)的中空NGC,在充分表征PCL、PCL/CNTs的理化性能及對神經(jīng)細(xì)胞的行為影響后對其體內(nèi)促神經(jīng)再生作用進(jìn)行驗(yàn)證。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)體系在此空心導(dǎo)管的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)可溶性CP聚(3-噻吩乙酸)(poly(3-thiopheneacetic acid),PTAA)及單寧酸(tannic acid,Ta)摻雜的聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA/PTAA/Ta,PPT)電紡纖維膜,并制作取向PPT(aligned-PLGA/PTAA/Ta,A-PPT)電紡纖維NGC。管腔填充物為搭載雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)的甲氧基聚乙二醇-聚丙氨酸-羧基化苯胺四聚體(mPEG-PLAla-CTA)溫敏性電活性水凝膠。充分表征支架及溫敏性電活性水凝膠的理化性質(zhì),體內(nèi)、體外驗(yàn)證該組織工程神經(jīng)移植物(tissue-engineered nerve graft,TENG)協(xié)同電刺激(electrical stimulation,ES)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)效果,對其促神經(jīng)再生機(jī)制進(jìn)行探討。材料與方法:首先通過調(diào)整滾輪轉(zhuǎn)速制作取向度可調(diào)的PCL及PCL/CNTs靜電紡絲纖維膜,并對其行掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、水接觸角、機(jī)械性能、熱行為、小角X射線散射(Small-angle X-ray scattering,SAXS)、電導(dǎo)率等表征。體外對腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma,PC12)細(xì)胞的神經(jīng)行為影響的基礎(chǔ)上,選擇最優(yōu)取向度的PCL/CNTs-1000 NGC用于大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型,術(shù)后3個(gè)月對其進(jìn)行運(yùn)動功能評價(jià)、組織學(xué)評價(jià)、神經(jīng)電生理及腓腸肌肌肉萎縮情況等評價(jià)其神經(jīng)再生情況。TENG實(shí)驗(yàn)中,首先通過3-噻吩乙酸單體經(jīng)無水三氯化鐵化學(xué)氧化合成聚(3-噻吩乙酸甲酯)(poly(3-thiophene methyl acetate),PTMA),之后堿化水解得到PTAA,通過類似實(shí)驗(yàn)一的方法制備A-PPT;通過氨基化的甲氧基聚乙二醇引發(fā)L-丙氨酸N-內(nèi)羧酸酐開環(huán)聚合,得到甲氧基聚乙二醇-聚丙氨酸(mPEG-PLAla)二嵌段共聚物,mPEG-PLAla與羧基化苯胺四聚體(carboxyl-capped tetraaniline,CTA)發(fā)生氨基與羧基的縮合反應(yīng)制備mPEG-PLAla-CTA水凝膠,對mPEG-PLAla-CTA水凝膠質(zhì)子核磁共振、傅里葉變換紅外光譜、相圖、流變學(xué)、循環(huán)伏安(cyclic voltammetry,CV)曲線、體內(nèi)體外降解等進(jìn)行充分表征,體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行SCs的細(xì)胞毒性、粘附和增殖實(shí)驗(yàn)。該TENG協(xié)同ES修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10 mm缺損實(shí)驗(yàn)中,通過術(shù)后3個(gè)月對其進(jìn)行運(yùn)動功能評價(jià)、組織學(xué)評價(jià)、神經(jīng)電生理及腓腸肌肌肉萎縮情況等評價(jià)其神經(jīng)再生情況,并對再生神經(jīng)組織中neurofilament-200(NF200)、髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)、β3-Tubulin(TUJ-1)蛋白表達(dá)通過免疫熒光進(jìn)行半定量結(jié)果分析其促神經(jīng)再生機(jī)制。結(jié)果:本研究成功制備了取向度可調(diào)的具備適宜的孔隙率、機(jī)械性能良好的導(dǎo)電性PCL/CNTs-1000 NGC,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具備引導(dǎo)PC12細(xì)胞定向粘附、增殖能力,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中術(shù)后3個(gè)月運(yùn)動功能評價(jià)結(jié)果:PCL/CNTs-1000,PCL/CNTs-0+ES和PCL/CNTs-0組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index,)評分分別為-56.89±10.12,-54.69±5.42和-69.48±5.49,顯著低于自體移植組(-29.7±8.64)和PCL/CNTs-1000+ES組評分(-31.00±4.98);自體移植和PCL/CNTs-1000+ES組的軸突髓鞘較厚,分別為0.87±0.32和0.68±0.24μm,PCL/CNTs-1000+ES組的復(fù)合肌肉動作電位(compound muscle action potential,CMAP)潛伏期為1.33±0.06 ms與自體移植組(1.27±0.08 ms)相當(dāng),比PCL/CNTs-0組的(2.01±0.10ms)短。健康雄性大鼠、自體移植組及PCL/CNTs-1000+ES的CMAP振幅分別為12.87±0.55 mV、6.82±0.92 mV、6.74±0.28 mV。PCL/CNTs-1000+ES支架組與自體移植組相當(dāng),PCL/CNTs-1000+ES組的CMAP峰值(6.42±0.47 mV)遠(yuǎn)高于PCL/CNTs-1000組的4.27±0.28 mV和PCL/CNTs-0組的3.48±0.77 mV);腓腸肌肌肉萎縮評價(jià)結(jié)果顯示PCL/CNTs-1000+ES組與自體移植組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,橫截面肌纖維面積占比與自體移植組也無差異;NF200,MBP,GFAP和TuJ-1染色蛋白進(jìn)行熒光強(qiáng)度半定量分析結(jié)果顯示蛋白在PCL/CNTs-1000+ES支架中的表達(dá)水平明顯高于其他組,且與自體移植組無差異。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中,制備的A-PPT電紡纖維膜取向度良好,且具有較好的親水性,A-PPT電紡絲膜沿取向方向的電導(dǎo)率分別為(0.21±0.06)×10~(-3) S/m,垂直于取向方向的電導(dǎo)率為(0.08±0.02)×10~(-4) S/m;隨機(jī)方向PLGA/PTAA/Ta(R-PPT)電紡絲膜電導(dǎo)率為(0.32±0.09)×10~(-4) S/m;制備的管腔填充物mPEG-PLAla-CTA水凝膠成膠性能良好,流變測試顯示其儲能模量高于100 Pa,CV曲線顯示其具備穩(wěn)定電活性;體外降解實(shí)驗(yàn)中分別于PBS,彈性蛋白酶,糜蛋白酶環(huán)境下30天后mPEG-PLAla-CTA降解為原重量的51.7±2.1%,35.0±2.6%,19.3±3.8%,體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)4周時(shí)間內(nèi)無明顯炎癥反應(yīng)出現(xiàn);體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該電活性水凝膠及A-PPT電紡膜同時(shí)顯示協(xié)同ES對SCs無明顯細(xì)胞毒性,可促進(jìn)SCs粘附與增殖。動物實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動功能評價(jià)中Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組的SFI評分分別為-36.30±3.67,-38.12±4.18,-42.86±1.62,三組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明術(shù)后3個(gè)月時(shí)A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組與Autograft組運(yùn)動功能恢復(fù)效果相當(dāng);再生神經(jīng)透射電鏡結(jié)果分析2500μm~2區(qū)域大小內(nèi)再生神經(jīng)軸突數(shù)量Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,平均值分別為101.2,96.0個(gè),二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組有髓軸突直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果4.8±0.5μm,4.2±0.4μm,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;髓鞘厚度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Autograft組為1.1±0.2μm,A-PPT-Gel-SCs-ES組為0.8±0.1μm,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。神經(jīng)電生理結(jié)果顯示Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組CAMP振幅分別為:6.89±0.15 mV,6.79±0.10 mV,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組CAMP潛伏期分別為:1.26±0.09 ms,1.27±0.05 ms,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;腓腸肌肌肉評價(jià)結(jié)果:Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組右側(cè)腓腸肌與健側(cè)腓腸肌重量比值結(jié)果分別為60.5±2.9%與64.2±2.6%,二者相比較結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Masson染色圖像中橫截面膠原與肌纖維比值,Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組占比最小,平均值分別為9.3%與11.3%,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;NF200,MBP,GFAP和TuJ-1染色蛋白進(jìn)行熒光強(qiáng)度半定量分析結(jié)果顯示蛋白在PCL/CNTs-1000+ES支架中的表達(dá)水平明顯高于其他組,且與自體移植組無差異。結(jié)論:本研究開發(fā)的PCL/CNTs-1000 NGC及A-PPT NGC填充搭載SCs的mPEG-PLAla-CTA溫敏性導(dǎo)電水凝膠的TENG協(xié)同外源性ES,在大鼠坐骨神經(jīng)缺損實(shí)驗(yàn)中SFI評分、CAMP振幅及潛伏期、軸突及髓鞘厚度、腓腸肌肌肉萎縮等結(jié)果與自體移植相當(dāng),均可促進(jìn)神經(jīng)特異性蛋白NF200、MBP、GFAP和TuJ-1表達(dá),說明該系列導(dǎo)電性NGC/TENG協(xié)同電刺激可有效針對外周缺損病理特點(diǎn),取向?qū)Ч芡ㄟ^物理引導(dǎo)作用實(shí)現(xiàn)軸突再生及髓鞘化,mPEG-PLAla-CTA溫敏性導(dǎo)電水凝膠其降解速率與神經(jīng)再生相匹配,可在傷后早期為NGC提供物理支撐,降解后遺留的間隙為再生神經(jīng)提供空間。協(xié)同外源性ES進(jìn)一步提高了該系列NGC/TENG的神經(jīng)修復(fù)效果,實(shí)現(xiàn)了周圍神經(jīng)缺損后的運(yùn)功功能、組織學(xué)、電生理方面的神經(jīng)精準(zhǔn)修復(fù)。PCL/CNTs-1000 NGC及A-PPT NGC填充搭載SCs的mPEG-PLAla-CTA溫敏性導(dǎo)電水凝膠的TENG的研發(fā)可有望提高極限修復(fù)長度,并最終取代自體神經(jīng)移植。本系列研究的成功實(shí)施將提供一類可修復(fù)極限長度外周神經(jīng)缺損的多功能組織工程神經(jīng)移植物,將產(chǎn)生積極的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

術(shù)后3個(gè)月對大鼠進(jìn)行運(yùn)動功能評價(jià),正常大鼠及Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組的足印照片見圖3.16,自體神經(jīng)移植組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組與正常大鼠足跡照片類似,1–5足趾及2–4足趾距離較寬,足跟至第三足趾距離較短,進(jìn)一步的SFI定量分析圖表見圖3.17。單純PLGA組結(jié)果效果最差,SFI評分為-80.94±5.31,其結(jié)果與另外6組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組平均值分別為-51.98,-55.51,-67.23。A-PPT組結(jié)果優(yōu)于R-PPT組,證明取向神經(jīng)導(dǎo)管對運(yùn)動功能恢復(fù)的重要作用;A-PPT-Gel組與A-PPT組效果無差異,且效果均較差,證明NGC管腔內(nèi)填充凝膠后尚需添加SCs,電刺激等因素進(jìn)一步增強(qiáng)恢復(fù)運(yùn)動功能能力;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組的運(yùn)動SFI評分分別為-36.30±3.67,-38.12±4.18,-42.86±1.62,三組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明術(shù)后3個(gè)月時(shí)A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組與Autograft組運(yùn)動功能恢復(fù)效果相當(dāng),如進(jìn)一步延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間,A-PPT-Gel-SCs-ES組有望進(jìn)一步恢復(fù)運(yùn)動功能,甚至取得比Autograft組更好的運(yùn)動功能效果。圖3.17術(shù)后3個(gè)月SFI評分結(jié)果(n=3;*與自體移植組比較p<0.05;#與A-PPT-Gel-SCs-ES組比較p<0.05;Δ與A-PPT-Gel-SCs組比較p<0.05;φ與A-PPT-Gel組比較p<0.05;ψ與A-PPT組比較p<0.05;ξ與R-PPT組比較p<0.05)。

圖3.16正常大鼠及Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組的足印照片。3.4.3.2 再生坐骨神經(jīng)組織學(xué)評價(jià)

術(shù)后3個(gè)月將電生理評價(jià)后大鼠行心臟灌注大鼠取神經(jīng)標(biāo)本,行H&E染色大鼠心臟灌注液為4%多聚甲醛PBS溶液;行甲苯胺藍(lán)染色、TEM制樣的大鼠心臟灌注液為2.5%戊二醛固定液。術(shù)中見各組再生神經(jīng)均完整連接神經(jīng)近端及遠(yuǎn)端斷端,Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組再生神經(jīng)瘢痕組織較少;A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組瘢痕組織相對較多。再生神經(jīng)的中段組織HE染色及TEM照片見圖3.18,由H&E染色結(jié)果可見,Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組組織量較多,可先新生血管生成,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組組織量明顯減少;圖3.19 ABC分別為軸突數(shù)量、有髓軸突直徑、髓鞘厚度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)2500μm2區(qū)域大小內(nèi)再生神經(jīng)軸突數(shù)量Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,平均值分別為101.2,96.0個(gè)。二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明ES對促進(jìn)軸突再生有促進(jìn)作用,A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組結(jié)果分別為80.9±3.1,58.33±3.3,49.8±2.9,30.7±2.6,31±1.3個(gè),各組統(tǒng)計(jì)差異結(jié)果見圖3.19 A,可見取向電紡絲、mPEG-PLAla-CTA電活性水凝膠、SCs均可作為獨(dú)立因素促進(jìn)軸突數(shù)量增加,但僅A-PPT-Gel-SCs-ES組與Autograft組無差異;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組有髓軸突直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果4.8±0.5μm,4.2±0.4μm,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,需要指出的A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組是A-PPT-Gel-SCs-ES組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;髓鞘厚度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Autograft組為1.1±0.2μm,A-PPT-Gel-SCs-ES組為0.8±0.1μm,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過以上分析可知PTAA神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)合填充搭載SCs的電活性水凝膠組織工程移植物可以有效促進(jìn)軸突數(shù)量增加,增加有髓軸突直徑和髓鞘厚度。圖3.19術(shù)后3個(gè)月軸突數(shù)量、有髓軸突直徑、髓鞘厚度(n=3;*與自體移植組比較p<0.05;#與A-PPT-Gel-SCs-ES組比較p<0.05;Δ與A-PPT-Gel-SCs組比較p<0.05;φ與A-PPT-Gel組比較p<0.05;ψ與A-PPT組比較p<0.05)。
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本文編號：2889817