目的認(rèn)知障礙是糖尿病引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的常見表現(xiàn)之一,其發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明。流行病學(xué)研究表明,2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus,T2DM)患者更容易發(fā)生阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD),反之亦然。同時,T2DM與AD之間存在許多共同的病理特點,如胰島素抵抗、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙、膽固醇代謝異常、炎癥因子浸潤、淀粉樣蛋白異常沉積等。近年來,基于人群的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies,GWAS)發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞2型髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)錯義突變導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞功能異常是AD發(fā)生發(fā)展的重要機制。然而,小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2在糖尿病認(rèn)知障礙中是否存在重要作用尚無相關(guān)研究報道。本課題旨在通過體內(nèi)、體外實驗探討TREM2對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和極化表型的調(diào)控作用,及其在糖尿病認(rèn)知障礙小鼠中的作用及機制。方法體外實驗:通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞建立TREM2過表達(dá)和干擾細(xì)胞模型,并通過脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)干預(yù)建立炎癥刺激細(xì)胞模型。細(xì)胞模型分為空白對照組(Con)、LPS+vector組、LPS+TREM2-OE組、LPS+TREM2-shRNA組。在mRNA水平,通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)檢測細(xì)胞炎癥相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的變化,以及M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的變化;免疫印跡實驗(Western blot,WB)檢測NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況;細(xì)胞免疫熒光(Immunofluorescence,IF)雙標(biāo)實驗分別檢測M1、M2極化表型標(biāo)志物蛋白水平變化。體內(nèi)實驗:雄性C57BL/6J小鼠予以高脂飲食(High-fat diet,HFD)喂養(yǎng)50周以建立糖尿病認(rèn)知障礙的動物模型,對照組小鼠則予以普通飲食(Normal chow diet,NCD)喂養(yǎng)。飲食喂養(yǎng)干預(yù)38周后,通過腦立體定位注射CD68啟動子的TREM2過表達(dá)腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)使雙側(cè)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2過表達(dá)。實驗小鼠根據(jù)注射TREM2過表達(dá)病毒(AAV-TREM2)和對照病毒(AAV-con)分為NCD-con組、HFD-con組、HFD-TREM2組。定位注射10周后,通過莫里斯水迷宮(Morris water maze,MWM)、Y迷宮(Y maze)、新事物識別實驗(Novel object recognition,NOR)分別評估小鼠學(xué)習(xí)、空間記憶、識別記憶功能的變化;腹腔葡糖耐量實驗(Intraperitoneal glucose tolerance test,ipGTT)明確小鼠葡萄糖代謝改變。高爾基染色(Golgi stain)分析海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分枝結(jié)構(gòu)復(fù)雜性、頂樹突樹突棘密度;透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察突觸超微結(jié)構(gòu);WB檢測海馬組織突觸相關(guān)蛋白synaptophysin、PSD95、spinophilin的表達(dá)水平。qPCR檢測小鼠海馬炎癥相關(guān)因子及M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平;WB檢測海馬NF-κB炎癥通路激活情況;鼠腦冰凍切片免疫熒光雙標(biāo)分析海馬M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況,并通過Image J分析小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)明確小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥激活的水平。結(jié)果體外細(xì)胞實驗表明,BV-2細(xì)胞在LPS刺激下TREM2表達(dá)水平降低,腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表達(dá)水平增加。LPS+TREM2-OE組,上述促炎因子表達(dá)明顯下調(diào),同時M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸合酶-1(Arginase-1,Arg-1)、YM1/2明顯升高;相反,LPS+TREM-shRNA組,促炎因子表達(dá)明顯上調(diào),M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物明顯降低。細(xì)胞免疫熒光提示TREM2抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物iNOS蛋白表達(dá)水平,增加M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD206蛋白表達(dá)水平。同時,TREM2過表達(dá)明顯抑制了LPS刺激下BV-2細(xì)胞NF-κB通路p-p65、p-ikb-α的蛋白表達(dá),而TREM2干擾則相反。動物實驗表明,海馬過表達(dá)TREM2改善了長期HFD誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)、空間記憶和識別記憶,表現(xiàn)為MWM實驗中潛伏期縮短、隱藏平臺穿越次數(shù)增加、目標(biāo)象限游泳路程占總游泳路程比值增加,Y迷宮實驗中自發(fā)交替頻率增加,NOR實驗中新事物偏好指數(shù)增加。長期HFD喂養(yǎng)使小鼠海馬神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)受損,而相對于HFD-con組,HFD-TREM2組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和頂樹突樹突棘密度均增加,突觸相關(guān)蛋白Synaptophysin、PSD95、Spinophilin表達(dá)增加,突觸超微結(jié)構(gòu)更加完整。HFD促使小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活及炎癥反應(yīng)加劇,與HFD-con組小鼠相比,HFD-TREM2組海馬炎癥反應(yīng)改善,IL-1β、TLR-4的mRNA表達(dá)水平下降,M2型標(biāo)志物Arg-1、YM1/2的表達(dá)水平升高;同時,p-p65、p-ikb-α表達(dá)下降,NF-κB通路的激活受抑制。TREM2過表達(dá)使HFD誘導(dǎo)的海馬阿米巴樣激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少,分枝狀的靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞增加,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞(iba-1~+/iNOS~+)減少,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞(iba-1~+/Arg-1~+)增多。結(jié)論海馬小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2過表達(dá)可改善長期HFD誘導(dǎo)的糖尿病認(rèn)知障礙小鼠海馬錐體神經(jīng)元樹突及突觸損傷,增加突觸相關(guān)蛋白表達(dá),并最終改善其認(rèn)知損害,其機制與TREM2促進小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,抑制NF-κB通路激活和炎癥反應(yīng)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R587.2;R749.1
【部分圖文】：

BV-2細(xì)胞系是通過癌基因改建原代培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞而獲得的永生細(xì)胞系,其形態(tài)學(xué)、表型及炎癥反應(yīng)等各項功能特點與小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞相似。為了驗證BV-2細(xì)胞在炎癥刺激下TREM2的變化趨勢,以及在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,TREM2的表達(dá)是否發(fā)生改變,我們分別使用LPS刺激的細(xì)胞炎癥模型和高濃度胰島素刺激的胰島素抵抗細(xì)胞模型來進行驗證。qPCR結(jié)果顯示,100ng/ml和1000ng/ml的LPS刺激24小時均可引起B(yǎng)V-2細(xì)胞TREM2的mRNA表達(dá)水平明顯下降,且濃度越高,下降越顯著(圖1.1 A,P<0.05)。隨后,我們通過WB檢測p-Akt的水平來判斷胰島素抵抗是否發(fā)生,與10nM正常濃度胰島素處理BV-2細(xì)胞相比,2μM高濃度胰島素干預(yù)細(xì)胞后,其p-Akt/Akt的比值明顯降低,提示BV-2細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗(圖1.1 B,P<0.05)。qPCR結(jié)果提示10nM正常濃度胰島素干預(yù)后,TREM2表達(dá)無明顯改變,而在胰島素抵抗情況下,TREM2表達(dá)下降(圖1.1 C,P<0.05)。因此,在上述細(xì)胞模型中,我們初步明確,TREM2的m RNA水平在炎癥刺激和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下均下調(diào)。2.2 TREM2抑制BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及NF-κB通路的激活

為了探討TREM2是否具有調(diào)控BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用,我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功建立了TREM2過表達(dá)(TREM2-OE)和干擾(TREM2-shRNA)的BV-2細(xì)胞模型,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率超過90%(圖1.2 A-C)。100ng/ml LPS刺激下,BV-2細(xì)胞明顯增加了TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的m RNA表達(dá)水平,提示炎癥反應(yīng)增加(圖1.2 D-G,P<0.05)。TREM2-OE抑制了LPS刺激下TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表達(dá),而TREM2-shRNA則促進了上述炎癥因子mRNA的表達(dá)(圖1.2 D-G,P<0.05)。通過該實驗提示TREM2具有抑制BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。那么,TREM2抑制炎癥的作用是通過什么通路來實現(xiàn)的呢?為此,結(jié)合文獻(xiàn)報道,我們對NF-κB通路的激活進行驗證,結(jié)果顯示TREM2-OE抑制了p65和ikb-α的磷酸化,而TREM2-shRNA則使其磷酸化增加(圖1.2 H,P<0.05)。提示,TREM2可通過抑制NF-κB通路的激活,從而改善炎癥反應(yīng)。圖1.2 TREM2抑制LPS刺激下BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及NF-κB通路的激活。

TREM2抑制LPS刺激下BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及NF-κB通路的激活。
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本文編號：2881301