研究背景與目的急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一組高度異質(zhì)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。細(xì)胞遺傳學(xué)異常是AML疾病診斷、評(píng)價(jià)預(yù)后和治療方案的選擇中最重要的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一。而應(yīng)用現(xiàn)有的染色體分析技術(shù),目前仍有約50%左右的成人AML患者未能發(fā)現(xiàn)有顯微鏡下可見(jiàn)的染色體核型異常。這些所謂正常核型的AML (cytogentically normal AML, CN-AML)患者通常被劃分在中等預(yù)后組,但臨床結(jié)局卻大不一樣,提示他們之間存在較大的異質(zhì)性,因此分子生物學(xué)異常在其發(fā)病和判斷預(yù)后中的價(jià)值就更為突出。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為科學(xué)家們從微觀層面發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)生機(jī)制提供了更寬闊的視野,在AML中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多特征性的分子異常,包括基因表達(dá)水平異常、基因突變以及基因的轉(zhuǎn)錄修飾等等,而且不斷有新的基因異常指標(biāo)被加入進(jìn)來(lái)。隨著更多新的基因異常出現(xiàn),科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)基因突變與預(yù)后的關(guān)系不能簡(jiǎn)單地用一個(gè)基因異常來(lái)解釋,不同突變組合有不同的臨床意義,各種基因突變綜合考慮才能較好地反應(yīng)患者的真實(shí)預(yù)后。因此臨床醫(yī)生需要更為詳盡的基因突變譜綜合判斷疾病的預(yù)后、指導(dǎo)個(gè)體化治療�，F(xiàn)在臨床研究的重點(diǎn)是如何在短時(shí)間內(nèi)獲得有價(jià)值的基因異常以指導(dǎo)制定合理的治療方案,目前多采用經(jīng)典的Sanger測(cè)序方法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行突變檢測(cè),該測(cè)序法可以檢測(cè)出各種各樣的突變類(lèi)型,但檢測(cè)靈敏度只有20%左右。用位點(diǎn)特異性PCR的方法進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)靈敏度可達(dá)1‰～1%,但只能對(duì)特定的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。若同時(shí)檢測(cè)若干個(gè)基因片段,時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng),檢測(cè)的基因片段越多,所需標(biāo)本量越大,分析越費(fèi)時(shí)間,費(fèi)用越昂貴。因此,傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的臨床工作的需求,成了制約AML分子研究及臨床應(yīng)用的瓶頸。臨床醫(yī)生希望的是在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)少量的標(biāo)本能夠獲得更多的信息,同時(shí)盡量減輕反復(fù)抽取患者骨髓等標(biāo)本帶來(lái)的痛苦。因此建立一套高效、快捷、靈敏而經(jīng)濟(jì)的新的檢測(cè)手段,來(lái)充分體現(xiàn)其在疾病個(gè)體化治療中的價(jià)值,是當(dāng)前臨床診斷和醫(yī)學(xué)研究急需而且是必要的。新一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing, NGS)具有通量大、測(cè)序時(shí)間短、精確度高、費(fèi)用低和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn),研究者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位和分析,在臨床檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用前景。Ion Torrent個(gè)體化基因組測(cè)序儀(Personal Genome Machine, PGM)是Thermo Life公司最新推出的一款新一代測(cè)序儀。Ion Torrent是一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代測(cè)序技術(shù),具有以下技術(shù)特點(diǎn)：準(zhǔn)確度高：使用無(wú)標(biāo)記的核苷酸及酶進(jìn)行測(cè)序,本底干擾低。通過(guò)對(duì)H+的檢測(cè),明顯提高堿基判讀準(zhǔn)確性；速度更快：測(cè)序時(shí)間僅為2-3小時(shí),單日測(cè)序量達(dá)Sanger測(cè)序法的數(shù)千倍以上；靈活性大：可以根據(jù)檢測(cè)要求靈活選擇通量為10M、100M和1G芯片。其應(yīng)用范圍覆蓋Sanger和已有高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用,如線粒體測(cè)序、微生物基因組測(cè)序、RNA測(cè)序,表觀遺傳學(xué),DNA擴(kuò)增子測(cè)序等。Thermo Life公司基于其多年做PCR的經(jīng)驗(yàn),推出了AmpliSeq建庫(kù)方案,該專(zhuān)利技術(shù)以多重PCR為反應(yīng)基礎(chǔ),同時(shí)又突破了以往多重PCR的已知障礙,僅利用少量的起始DNA,就可以實(shí)現(xiàn)成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo)基因的擴(kuò)增能夠在單管多重PCR反應(yīng)內(nèi)完成。目前該技術(shù)用于AML突變檢測(cè)的研究還較少,商業(yè)化的Cancer Hotspot Panel中大多涉及的是實(shí)體腫瘤基因突變,而AML一些新發(fā)現(xiàn)的基因并不在此列,Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)的可擴(kuò)展性允許研究人員可以根據(jù)自己的研究目的適當(dāng)?shù)脑黾訙y(cè)序目的基因。我們?cè)贗on AmpliSeq Cancer HotspotPanel V2試劑盒基礎(chǔ)上,新增了一些AML相對(duì)特異的基因突變：WT1、 DNMT3A、CEBPA、RUNX1、PHF6、ASXL1、MLL、JAK1、 PAX5、SF3B1、 SH2B3、SRSF2、TET2、EBF1、DNMT1、DNMT3B、DNMT3L17個(gè)基因,重新設(shè)計(jì)定制了多重PCR測(cè)序引物池。新設(shè)計(jì)的試劑盒一方面盡可能的囊括目前有臨床指導(dǎo)意義的基因,另一方面,也希望能發(fā)現(xiàn)一些新的位點(diǎn)異常。本課題第一部分的目的在于研究Ion Torrent PGMTM測(cè)序平臺(tái)及自制的AML Cancer Panel在AML臨床診斷中的方法學(xué)建立。伴有t(8；21)(q22；q22)遺傳學(xué)異常的AML是較常見(jiàn)的一類(lèi)AML,約占成人AML的10%-15%,90%的t(8；21)易位發(fā)生在FAB分型AML-M2中,其余見(jiàn)于M0、M1、M4及骨髓增生異常綜合征(MDS)和治療相關(guān)性AML中,伴有這類(lèi)染色體易位的AML通常被認(rèn)為預(yù)后較好,特別是高劑量阿糖胞苷作為強(qiáng)化鞏固治療手段后,但此類(lèi)AML異質(zhì)性較大,仍然有30-50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)并對(duì)化療藥物耐藥。提示了一些患者可能伴有不良的分子事件,并暗示我們需要尋找新的提示預(yù)后的標(biāo)記并據(jù)此來(lái)調(diào)整治療方案。以往研究基因突變的傳統(tǒng)方法Sanger測(cè)序因技術(shù)本身的局限性,使其在研究基因突變譜時(shí)受到了很大的限制,因此對(duì)t(8；21)AML細(xì)胞基因突變研究往往集中在有限的目標(biāo)基因中。更鮮有報(bào)道從大范圍目標(biāo)基因水平上來(lái)比較t(8；21)AML初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)的基因突變譜變化。本課題第二部分利用新建立的Ion Torrent PGMTM測(cè)序平臺(tái),對(duì)t(8；21)AML患者初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)自身配對(duì)骨髓標(biāo)本的基因突變情況進(jìn)行檢測(cè),以期從分子生物學(xué)角度分析t(8；21)AML患者初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)的克隆演化情況,為該類(lèi)患者選擇合適的再治療措施提供依據(jù)。材料與方法第一部分研究對(duì)象：2012.10-2013.12期間在南方醫(yī)院血液科診治的初發(fā)CN-AML患者標(biāo)本27例,采集研究對(duì)象初次治療前的骨髓標(biāo)本,其中14例患者從新鮮骨髓標(biāo)本中提取核酸待檢,13例患者從骨髓細(xì)胞涂片上提取核酸待檢。方法：1、目標(biāo)基因篩選和多重PCR引物設(shè)計(jì)利用Ion AmpliSeq Designer (www.ampliseq.com)引物設(shè)計(jì)工具,對(duì)感興趣的67個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行多重PCR引物設(shè)計(jì),其中50個(gè)基因的信息來(lái)自IonAmpliSeqTM Cancer Panel V2方案,另增加的17個(gè)基因信息通過(guò)大量查閱文獻(xiàn)獲得。2、樣本準(zhǔn)備按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,分別從骨髓細(xì)胞涂片和新鮮骨髓標(biāo)本中提取核酸。3、NGS測(cè)序1)構(gòu)建文庫(kù)用Qubit dsDNA試劑盒檢測(cè)DNA濃度,稀釋到5ng/ul。依據(jù)儀器配套試劑盒說(shuō)明書(shū),經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)DNA、消化引物、加barcode接頭、純化擴(kuò)增文庫(kù)后,采用Ion Library Quantitation Kit對(duì)文庫(kù)定量。2)乳液PCR和陽(yáng)性模板富集采用Ion PGMTM Template OT2 200 Kit進(jìn)行乳液PCR；用Dynabeads(?) MyOneTM Streptavidin C1 Beads進(jìn)行陽(yáng)性模板富集。以上兩步反應(yīng)在Ion OneTouchTM ES儀上進(jìn)行。3) Ion Torrent PGM測(cè)序用The Ion 316 Chip Kit,在PGM上測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用PGM服務(wù)器配套的Ion Torrent Software Suite數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行初步分析,得到整體數(shù)據(jù)量、變異信息、平均測(cè)序深度和參考序列匹配程度等數(shù)據(jù)。原始結(jié)果再經(jīng)過(guò)一系列的過(guò)濾條件之后,得到最終結(jié)果。參考序列為人類(lèi)基因組GRCh37。4、Sanger測(cè)序用傳統(tǒng)的Sanger方法檢測(cè)所有標(biāo)本的FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A三個(gè)基因的突變情況作為對(duì)照。第二部分研究對(duì)象：按照WH02008診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷的復(fù)發(fā)t (8; 21) AML患者11例,分別選取每1例患者初次診斷治療前和復(fù)發(fā)時(shí)的自身配對(duì)骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究。方法：1、NGS測(cè)序方法與第一部分相同。2、Sanger測(cè)序用Sanger測(cè)序檢測(cè)所有標(biāo)本的C-KIT基因8和17號(hào)外顯子的突變情況作為對(duì)照。3、突變位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)用polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、mutationtaster (http://www.mutationtaster.org/cgi-bin/MutationTaster/MutationTaster69.cgi)和MAPP-MMR (http://mappmmr.blueankh.com/)三款軟件來(lái)預(yù)測(cè)重現(xiàn)性突變位點(diǎn)的致病性。結(jié)果第一部分1、Ion AmpliseqTM Desinger多重PCR引物設(shè)計(jì)方案用Ion AmpliseqTM Desinger對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)多重PCR引物,設(shè)計(jì)方案結(jié)果：共652個(gè)擴(kuò)增子,可以覆蓋98.03%的目標(biāo)區(qū)域,PCR擴(kuò)增在兩管內(nèi)完成,分別有332和320個(gè)擴(kuò)增子,擴(kuò)增子的長(zhǎng)度在125bp和275之間。2、NGS質(zhì)控以一張芯片結(jié)果為例,測(cè)序結(jié)果顯示：芯片中磁珠覆蓋面積為80%,其中連接有文庫(kù)的為100%,除去34%的多克隆,12%的低質(zhì)量文庫(kù)和1%測(cè)試片段,最終有效的文庫(kù)為57%,共2,884,511個(gè)讀取片段；產(chǎn)生的原始測(cè)序數(shù)據(jù)總量為409Mb：平均擴(kuò)增子長(zhǎng)度為139bp；測(cè)序每次添加核苷酸時(shí),釋放的H+強(qiáng)度較一致；不同位置堿基的準(zhǔn)確度都在98%以上；其中達(dá)到Q20(與參考序列99%匹配)的為352 Mb。單個(gè)樣品測(cè)序質(zhì)控顯示：測(cè)序覆蓋度較均一,可以與靶標(biāo)區(qū)比對(duì)上的reads總數(shù)為493,804,占總靶標(biāo)區(qū)的96.15%,每個(gè)堿基的平均覆蓋度為517,堿基覆蓋的均一度為85.15%,可以被reads覆蓋的靶標(biāo)區(qū)的堿基比例為94.51%,靶標(biāo)區(qū)內(nèi)至少有20條reads比對(duì)上的堿基的比例為97.47%,沒(méi)有正/反鏈偏好性的堿基的比例為81.92%,大部分?jǐn)U增子的GC含量都在50%附近,每個(gè)擴(kuò)增子的覆蓋度比較均一,大部分分布在100-1000x之間,能從頭到尾測(cè)通的reads大部分超過(guò)了50%。說(shuō)明NGS質(zhì)控合格。3、樣本突變整體分布經(jīng)過(guò)查詢dbSNP、COSMIC等數(shù)據(jù)庫(kù)以及參照文獻(xiàn)報(bào)道,去除常見(jiàn)SNP位點(diǎn)后,67個(gè)目標(biāo)基因中,有兩例以上出現(xiàn)重現(xiàn)性突變的基因共有18個(gè),突變類(lèi)型包括單堿基替換、插入和缺失。突變發(fā)生頻率最高的是NPM1、DNMT3A. FLT3和TET2(突變頻率分別為22.2%,22.2%,18.5%和18.5%)。如：NPM1的插入突變集中在12號(hào)外顯子上4個(gè)堿基的插入(c.859_860insTCTG, c.861_862insTGCA),其中5例患者為A型突變,均插入TCTG四個(gè)堿基,引起NPM1蛋白C端的框移突變；FLT3突變有兩種模式,插入突變和點(diǎn)突變,3例為發(fā)生在近膜結(jié)構(gòu)域14、15外顯子的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(ITD)插入,2例為激酶結(jié)構(gòu)域20外顯子的第835個(gè)天門(mén)冬氨酸的點(diǎn)突變(TKD),其中1例患者同時(shí)有ITD和TKD兩種突變。DNMT3A和TET2屬于表觀遺傳調(diào)節(jié)基因子,以點(diǎn)突變?yōu)橹?DNMT3A檢出的6例突變中,5例為發(fā)生在23號(hào)外顯子上第882位點(diǎn)精氨酸的點(diǎn)突變,其中4例為R882H,1例為R882C。測(cè)序結(jié)果不但可以顯示基因突變的類(lèi)型,在染色體上的位置,還可以顯示突變堿基所占的比例,進(jìn)而可以用于疾病進(jìn)展過(guò)程中微小殘留的監(jiān)測(cè)。4、Sanger測(cè)序結(jié)果對(duì)所有標(biāo)本的FLT3-ITD(exon14、15)、NPM1 (exon12)和DNMT3A(R882位點(diǎn)附近)進(jìn)行經(jīng)典的Sanger測(cè)序,共檢測(cè)到：FLT3-ITD陽(yáng)性4例,NPM1陽(yáng)性6例,DNMT3A陽(yáng)性5例。與NGS結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),在擴(kuò)增目的片段一致的前提下,NPM1和DNMT3A的檢測(cè)兩種方法有很好的一致性,Sanger測(cè)序檢測(cè)到FLT3-ITD突變4例陽(yáng)性樣品中,僅有1例用NGS未測(cè)出。第二部分1、NGS質(zhì)控本部分研究檢測(cè)的芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控均合格,所有測(cè)序樣本的測(cè)序深度均在100-399X之間,90%以上的序列可以與靶標(biāo)區(qū)目的序列比對(duì)上,靶標(biāo)區(qū)堿基覆蓋度較均一。2、NGS測(cè)序結(jié)果對(duì)11例t(8；21)AML患者初診和復(fù)發(fā)時(shí)的自身配對(duì)骨髓標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了NGS測(cè)序,結(jié)果顯示：所有檢出的突變以雜合型突變?yōu)橹?而且在初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)的突變細(xì)胞比例基本一致。基因突變類(lèi)型以單堿基替換為主。這些復(fù)發(fā)的患者在初診時(shí)每例檢測(cè)到1-4個(gè)基因突變,發(fā)生頻率最高的是C-KIT (6/11),包括D816 (exon17)突變3例(其中,D816Y、D816H、D816V各1例),N822(exon17)突變1例,M541 (exon10) 1例,R815_D816ins (exon17)1例；ASXL1、MLH1和TET2突變各2例；FBXW7、DNMT3A、NRAS和DNMT3B突變各1例。復(fù)發(fā)時(shí),原有的6例C-KIT突變僅有4例仍然存在,2例丟失；新獲得了KIT P665突變1例,KITP665、KIT N822突變1例。與初次診斷時(shí)相比,復(fù)發(fā)時(shí)有5例患者的基因突變模式未發(fā)生變化,6例發(fā)生了變化,其中新獲得的基因包括KMT2A、C-KIT、TET2和SH2B3,丟失的原有基因包括C-KIT和NRAS。分別有2例患者在復(fù)發(fā)時(shí)獲得了KMT2A、C-KIT、TET2突變,1例獲得了SH2B3突變；2例患者復(fù)發(fā)時(shí)丟失了C-KIT,1例丟失了NRAS。3、Sanger測(cè)序結(jié)果及其驗(yàn)證為了驗(yàn)證NGS測(cè)序結(jié)果的可靠性,用Sanger方法測(cè)序檢測(cè)了所有標(biāo)本的C-KIT外顯子8、17的突變情況。在初次診斷標(biāo)本中檢測(cè)出17外顯子突變5例(D816 3例,N822 1例,R815_D816insl例),復(fù)發(fā)標(biāo)本檢測(cè)出17外顯子突變3例(D816、N822和R815_D816ins各1例),未檢測(cè)出8號(hào)外顯子突變,結(jié)果顯示兩種方法的一致性為100%。4、重現(xiàn)性突變的MLH1致病性測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示,有2例患者在初次診斷和復(fù)發(fā)時(shí)均出現(xiàn)MLHlc.1151TA突變,在本研究第一部分正常核型AML患者的基因突變譜中,也檢測(cè)出3例患者攜帶該突變,因此對(duì)該突變的原始結(jié)果進(jìn)行了仔細(xì)分析,該位點(diǎn)的測(cè)序深度均在100X以上,均為雜合突變,位于其擴(kuò)增子的中間部位。三款軟件來(lái)預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)的致病性,polyphen-2預(yù)測(cè)的得分為0.998,為probably damaging; mutationtaster預(yù)測(cè)的結(jié)果為disease causing; MAPP-MMR預(yù)測(cè)的得分為5.120(得分大于4.55為具有致病性)。結(jié)論1、本研究采用Ion Torrent PGMTM測(cè)序平臺(tái),在原有商業(yè)化實(shí)體腫瘤基因突變?cè)噭┖械幕A(chǔ)上成功加載了對(duì)AML預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值的17個(gè)基因,經(jīng)過(guò)27例染色體核型正常的AML患者樣本的檢測(cè)以及與經(jīng)典的測(cè)序方法比較,結(jié)果證明成功的建立了一套靈敏特異、可靠、高通量的AML突變檢測(cè)方法。2、Ion Torrent PGMTM在長(zhǎng)片段插入或缺失和單個(gè)堿基出現(xiàn)多次重復(fù)(即Homopolymer)區(qū)段的檢測(cè)中還有一定的缺陷。3、在動(dòng)態(tài)研究初次診斷和緩解后復(fù)發(fā)的伴有t(8；21)染色體核型異常的AML患者中,發(fā)現(xiàn)大部分患者出現(xiàn)了與初次診斷時(shí)不同的基因突變模式,其中C-KIT基因突變?yōu)樽畛Ｒ?jiàn)類(lèi)型。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R733.71;R440
【部分圖文】：

預(yù)后良好的優(yōu)越性只有在ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＭＬＸ－ＰＴＤ、ＤＮＭＴ３Ａ等基因沒(méi)有突??變的情況下才能顯現(xiàn)出來(lái)［４］�？傊�，ＡＭＬ中各種基因突變并不是單獨(dú)存在，而??且不同組合有不同的臨床意義（圖１－１）?［３］，因此臨床醫(yī)生需要更為詳盡的基因??突變譜，采用不同基因突變的組合去判斷疾病的預(yù)后、指導(dǎo)個(gè)體化治療。??圖１－１?ＡＭＬ患者各種基因突變發(fā)生頻率及基因突變共發(fā)生情況??Ｆｉｇ?１－１?Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ?ａｎｄ?ｐａｉｒｗｉｓｅ?ｃｏ－ｏｃｃｕｒｒｅ打ｃｅ?ｏｆ?ｍｕｔａｔｉｏｎｓ?ｉｎ?ＡＭＬ??２??

Ｆｉｇ?１－２?Ｗｏｒｋ円ｏｗ?ｏｆ?Ｉｏｎ?Ｔｏｒｒｅｎｔ??（法ｉ?１、脫氧核巧酸分子流過(guò)忍片微孔；２、若脫氧核巧酸與微孔中的ＤＮＡ分子互補(bǔ)，??該核巧酸被即合成到ＤＮＡ分子中，同時(shí)釋放氨離子，使該孔溶液的ＰＨ值發(fā)生變化；３、??感應(yīng)層檢測(cè)到ＰＨ變化；４、感應(yīng)層將ＰＨ變化的化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷鹤兓畔�；５、電�??變化信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息。如果ＤＮＡ鏈含有兩個(gè)相同的堿基，則記錄電壓信號(hào)是雙??倍的。如果堿基不匹配，則無(wú)氨離子釋放，也就沒(méi)有電壓信號(hào)的變化。）??Ｉｏｎ?Ｔｏｒｒｅｎｔ是目前世界上唯一使用半導(dǎo)體芯片測(cè)序的高通量測(cè)序儀，儀器??硬件無(wú)需激光等激發(fā)光源和ＣＣＤ等光學(xué)檢測(cè)設(shè)備，配套試劑也無(wú)需巧光標(biāo)記和??焦磯酸酶化學(xué)級(jí)聯(lián)，僅使用未經(jīng)修飾的核昔酸和聚合酶等天然試劑，直接實(shí)時(shí)??檢測(cè)ＤＮＡ聚合時(shí)產(chǎn)生的Ｈ＋離子流ＰＨ值變化，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單真實(shí)的生物化學(xué)原??理。具有出色的測(cè)序覆蓋均衡度，因此可使現(xiàn)有第二代測(cè)序技術(shù)存在的測(cè)序數(shù)??據(jù)偏差（ＧＣ?ｂｉａｓ）降低到前所未有的水平。其應(yīng)用范圍覆蓋Ｓａｎｅｒ測(cè)序和己有??

２．７．１?Ｓａｎｇｅｒ測(cè)序結(jié)果??對(duì)所有標(biāo)本的?ＦＬＴ３－ＩＴＤ（ｅｘｏｎｌ４、１５）、ＮＰＭｌ（ｅｘｏｎｌ２）和?ＤＮＭＴ３Ａ（Ｒ８８２??位點(diǎn)附近）進(jìn)行經(jīng)典的Ｓａｎｇｅｒ方法測(cè)序作為驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖１－９，?Ｓａｎｇｅｒ??測(cè)序共檢測(cè)到；ＦＬＴ３－ＩＴＤ陽(yáng)性４例，ＮＰＭ１陽(yáng)性６例，ＤＮＭＴ３Ａ陽(yáng)性５例。??２７??

本文編號(hào)：2871813