1研究背景目前,心血管疾病目前已成為發(fā)達(dá)國家最常見的致死疾病,而動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理原因。對于危及生命的冠狀動脈粥樣硬化患者,血管成形術(shù)、支架植入術(shù)、動脈粥樣硬化斑塊切除和旁路移植術(shù)等手術(shù)治療仍然是不可缺少的手段。然而,機(jī)械損傷后導(dǎo)致的血管再狹窄是限制患者預(yù)后的最突出的病理問題。血管再狹窄是以血管中膜層增厚導(dǎo)致動脈新生內(nèi)膜形成為特征的血管性疾病。術(shù)后血管再狹窄是位于手術(shù)擴(kuò)張局部血管中膜平滑肌細(xì)胞移行至內(nèi)膜并在內(nèi)膜增殖,產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì),造成血管內(nèi)膜明顯增厚,從而形成新生內(nèi)膜收縮型和合成型兩種表現(xiàn)為特征的血管重塑性疾病。因此,探討VSMCs增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的影響因素和分子機(jī)制在血管新生內(nèi)膜導(dǎo)致的血管再狹窄的防治中具有重要意義。NONO(即人p54nrb)是一個無POU結(jié)構(gòu)域的八聚體結(jié)合蛋白,與SFPQ、PSPC1蛋白和長非編碼RNA NEAT1共同構(gòu)成DBHS蛋白家族。NONO蛋白具有RRMs、NOPS和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,可作為轉(zhuǎn)錄因子或剪切因子參與蛋白-蛋白互作和蛋白-核酸互作,在DNA損傷、RNA合成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),NONO還參與了乳腺癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、主動脈夾層及動脈粥樣硬化等多種疾病。NONO作為一種多功能核蛋白,還被證實(shí)參與自身免疫性疾病的炎癥因子分泌等多種病理過程。我們在前期的研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NONO蛋白明顯抑制ApoE-/-小鼠粥樣硬化斑塊纖維帽的形成、抑制斑塊內(nèi)膠原的沉積,進(jìn)而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定,促進(jìn)ApoE-/-小鼠粥樣硬化斑塊的進(jìn)展;而降低NONO蛋白的表達(dá),通過促進(jìn)膠原沉積、抑制炎癥因子的表達(dá)水平,發(fā)揮穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的作用。然而NONO蛋白對血管新生內(nèi)膜的作用及機(jī)制尚未明確,仍需進(jìn)一步探索。2研究目的(1)檢測NONO蛋白在人體冠狀動脈組織和小鼠新生內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平;(2)檢測NONO對正常幼年小鼠血管形態(tài)的影響;(3)檢測NONO蛋白缺失對小鼠頸動脈結(jié)扎導(dǎo)致的血管新生內(nèi)膜的影響;(4)探索NONO對血管新生內(nèi)膜影響的潛在機(jī)制。3研究方法3.1利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得NONO基因敲除小鼠本實(shí)驗室姜虹教授利用CRISPR/Cas9技術(shù)在C57BL/6J背景小鼠中得到NONOgt/0敲基因小鼠。NONO基因位于X染色體,通過雜合母鼠NONOgt/+和野生型WT雄鼠雜交,獲得NONOgt/0敲基因小鼠及其同窩對照的NONO+/0野生WT雄鼠。3.2頸動脈結(jié)扎小鼠模型的構(gòu)建穩(wěn)定繁殖10代后的NONO敲基因鼠及其同窩對照WT雄鼠為本實(shí)驗中的所有研究用鼠。9-10周NONO基因敲除小鼠及同窩對照WT雄鼠于左側(cè)頸動脈結(jié)扎21天后取材。3.3動物取材腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠,稱量體重后固定。心尖取血后留取血清,檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)水平。生理鹽水充分灌流后,留取小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟及兩側(cè)頸動脈,置于4%多聚甲醛或液氮中保存。頸動脈組織于甲醛固定24小時后流水沖洗,梯度酒精脫水后石蠟包埋。石蠟切片機(jī)進(jìn)行5 μm連續(xù)切片。3.4組織蛋白提取采用Invent MinuteTM蛋白提取試劑盒,將液氮保存的人冠脈組織及小鼠組織放入離心管套柱中,按照1mg組織對應(yīng)10μl體積的比例加入變性總蛋白提取裂解液,用研磨棒充分研磨后高速離心獲得組織蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液后99℃煮沸10 min使蛋白變性。3.5組織切片染色頸動脈切片分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、Verhoeff氏酒精蘇木素染色、免疫組織化學(xué)染色及組織免疫熒光染色。測量血管新生內(nèi)膜面積、新生內(nèi)膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的含量、NONO表達(dá)水平的檢測、PCNA及Ki67等增值指標(biāo)表達(dá)水平的檢測、SPHK1及S1PR1等遷移指標(biāo)表達(dá)水平的檢測。3.6小鼠原代平滑肌細(xì)胞VSMCs的提取與培養(yǎng)5-6周大小的NONOgt/0敲基因小鼠及其同窩對照的WT雄鼠用于提取小鼠原代平滑肌細(xì)胞。剝離、冷PBS清洗小鼠的主動脈后,采用組織貼壁法提取VSMCs,在含20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并按照常規(guī)方法傳代。3.7人原代平滑肌細(xì)胞HASMCs的培養(yǎng)HASMCs購買于美國ScienCell公司,采用SMCM培養(yǎng)基培養(yǎng)并按常規(guī)方法傳代。3.8 VSMCs細(xì)胞遷移的檢測采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗檢測有無20ng/ml的PDGF-BB刺激對WT和NONO KO的VSMCs細(xì)胞遷移的影響3.9 VSMCs細(xì)胞增殖的檢測采用細(xì)胞周期檢測試劑盒和CCK8檢測20ng/ml的PDGF-BB對WT和NONO KO的VSMCs細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖能力的影響。3.10逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-PCR)組織RNA采用Qiagen的RNA提取試劑盒提取。細(xì)胞RNA采用Fastagen的RNA提取試劑盒提取。步驟均參照試劑盒說明書。Nanodrop檢測RNA濃度后,采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA,SYBR及特異性引物進(jìn)行實(shí)時定量PCR,檢測NONO、PCNA、p21、SPHK1、S1PR1、α-SMA、CNN1、SM22α的 mRNA 表達(dá)水平。3.11細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞免疫熒光檢測20ng/ml的PDGF-BB對WT和NONO KO的VSMCs細(xì)胞誘導(dǎo)的Erkl/2表達(dá)水平及細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響。3.12 蛋白質(zhì)印記法(Western blot,WB)收集人冠脈組織及小鼠動脈組織和細(xì)胞,提取蛋白,檢測組織NONO及VSMCs細(xì)胞內(nèi) NONO、PCNA、p21、α-SMA、SM22α、p-MEK1、t-MEK1、p-Erk1/2、t-Erk1/2的蛋白表達(dá)水平,以GAPDH作為內(nèi)參。3.13蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)適用于IP實(shí)驗的RIPA及PMSF裂解VSMCs細(xì)胞蛋白,檢測20ng/ml的PDGF-BB刺激細(xì)胞后NONO與Erk1/2相互結(jié)合的情況。3.14人冠狀動脈組織的獲取冠狀動脈組織來自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管實(shí)驗室。從器官供者的移植心臟獲取冠狀動脈,并在手術(shù)室內(nèi)以最短的缺血時間(15分鐘)進(jìn)行處理。由經(jīng)驗豐富的心臟外科醫(yī)生根據(jù)器官供者冠狀動脈粥樣硬化的不同程度,將動脈段劃分為健康或病變。研究方案由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn)科研倫理號:KYLL-2016-333。3.15統(tǒng)計分析實(shí)驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。應(yīng)用SPSS 19和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及作圖。對于符合正態(tài)分布的兩組樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗,多樣本間比較采用單因素方差分析One-way ANOVA檢驗,其下的各組間事后檢驗采用Dunnett's多重檢驗;對于不符合正態(tài)分布的樣本比較采用非參數(shù)檢驗。雙側(cè)P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。4研究結(jié)果4.1 NONO在人體狹窄的冠脈組織和WT小鼠頸動脈結(jié)扎組織中的表達(dá)增加人體粥樣硬化斑塊導(dǎo)致的狹窄冠脈組織中NONO的RNA水平及蛋白水平均顯著高于正常冠脈組織中NONO的表達(dá)水平(P0.05);在WT小鼠頸動脈結(jié)扎后內(nèi)膜新生的動脈組織NONO的RNA水平及蛋白水平均明顯高于對側(cè)正常的小鼠頸動脈組織(P0.05)。4.2 NONO蛋白主要分布在平滑肌細(xì)胞內(nèi)人粥樣硬化斑塊導(dǎo)致的狹窄冠脈組織及WT小鼠頸動脈結(jié)扎導(dǎo)致血管新生內(nèi)膜的組織免疫熒光染色顯示,NONO與SM22α的熒光共定位最多,推測在狹窄的冠脈及內(nèi)膜新生組織中,NONO蛋白主要分布在平滑肌細(xì)胞內(nèi)。4.3 NONO基因敲除小鼠及其同窩對照小鼠的基本情況通過CRISPR/Cas9技術(shù)在C57BL/6J背景小鼠中得到NONOgt/0敲基因小鼠。NONOgt/0雄鼠的體重、出生率和存活率嚴(yán)重低于同窩對照的WT雄鼠,此外,與WT小鼠相比,NONO KO小鼠的顱面形態(tài)也發(fā)生了變化。在NONOgt/0敲基因小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦及主動脈血管等組織中均不存在NONO蛋白的表達(dá)。9-10周齡的NONO基因敲除小鼠及其同窩對照小鼠的血清TC、TG、LDL-C及HDL-C表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異,提示NONO對小鼠的血脂水平無影響。但NONO基因敲除小鼠的體重明顯低于同窩對照的WT小鼠(P0.05),提示NONO對小鼠的生長發(fā)育有影響。4.4 NONO蛋白不參與小鼠血管形態(tài)的維持NONO蛋白缺失會導(dǎo)致小鼠體重減輕,但對血管形態(tài)的維持無影響。分別取4周、5周、6周齡NONOgt/0敲基因小鼠及其同窩對照WT雄鼠的左側(cè)頸動脈HE染色,顯示2組小鼠血管內(nèi)徑及血管中膜厚度均無顯著差異。此外,NONO蛋白缺失會影響DBHS蛋白家族PSPC1的表達(dá),對SFPQ的表達(dá)量無影響。4.5 NONO蛋白缺失抑制小鼠結(jié)扎血管的內(nèi)膜新生Verhoeff染色顯示NONO蛋白缺失明顯抑制了小鼠結(jié)扎頸動脈血管的內(nèi)膜新生(P0.05)。4.6 NONO蛋白缺失抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖組織免疫熒光染色及組織化學(xué)染色顯示,NONO蛋白缺失通過抑制Ki67及PCNA的表達(dá)明顯抑制血管新生內(nèi)膜病理過程中的細(xì)胞增殖作用(P0.05)。體外培養(yǎng)原代VSMCs的實(shí)驗結(jié)果進(jìn)一步顯示,NONO蛋白缺失明顯抑制PDGF-BB刺激下細(xì)胞周期中的合成期(S期)、抑制細(xì)胞增殖(P0.05),同時WB及PCR結(jié)果顯示NONO KO能顯著抑制PDGF-BB刺激下的VSMCs中PCNA表達(dá)量(P0.05),顯著增加p21的表達(dá)量(P0.05)。4.7 NONO蛋白缺失抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移和表型轉(zhuǎn)換組織化學(xué)染色顯示,NONO蛋白缺失通過抑制SPHK1及S1PR1的表達(dá)明顯抑制血管新生內(nèi)膜病理過程中的細(xì)胞遷移作用(P0.05)。體外培養(yǎng)原代VSMCs的實(shí)驗結(jié)果進(jìn)一步顯示,NONO蛋白缺失明顯抑制細(xì)胞遷移(P0.05),PCR結(jié)果顯示NONO KO明顯抑制PDGF-BB刺激下的VSMCs中SPHK1及S1PR1的表達(dá)量顯著下降(P0.05)。同時WB及PCR結(jié)果顯示,PDGF-BB刺激的NONO KO的VSMCs中平滑肌收縮表型α-SMA、CNN1、SM22α的表達(dá)水平顯著增加(P0.05)。4.8 NONO蛋白與Erk1/2相互作用共同調(diào)控血管新生內(nèi)膜中VSMCs的作用細(xì)胞免疫熒光染色顯示,在PDGF-BB的刺激下,WT VSMCs中Erk1/2發(fā)生明顯核轉(zhuǎn)位,而NONO KO能夠顯著抑制Erk的核轉(zhuǎn)位。免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)NONO蛋白能夠與Erk1/2蛋白相互結(jié)合。WB結(jié)果進(jìn)一步顯示,NONO KO降低PDGF-BB刺激下Erk1/2的磷酸化表達(dá)水平。5結(jié)論(1)血管新生內(nèi)膜的NONO蛋白主要存在于平滑肌細(xì)胞中,NONO蛋白缺失明顯抑制血管重塑的病理過程;(2)NONO蛋白缺失對血管的完整性無影響;(3)NONO蛋白缺失通過抑制VSMCs的增殖、遷移、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,抑制新生內(nèi)膜,并通過抑制Erk1/2的磷酸化水平發(fā)揮作用。1研究背景腹主動脈瘤(AAA)是一種慢性退行性血管疾病,病人常突發(fā)動脈瘤破裂、猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥。目前,世界上每年至少20萬人死于AAA,而其中瘤體破裂出血占AAA患者死因的90%。對于AAA瘤體巨大的患者而言,外科手術(shù)進(jìn)行血管修復(fù)是目前唯一可行的辦法;而對于瘤體較小的患者,仍缺乏行之有效的藥物治療或手術(shù)替代療法。AAA的病理過程包括細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受損及炎性反應(yīng)。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要調(diào)控因子,促進(jìn)AAA的基質(zhì)降解、慢性炎癥浸潤及血管重塑。一方面,轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失活通過抑制ECM合成及促進(jìn)基質(zhì)降解,促進(jìn)AAA的病理性發(fā)展。而TGF-β1通過促進(jìn)膠原合成的關(guān)鍵限速酶輔氨酰-4-羥化酶α1(P4Hα1)的合成促進(jìn)膠原的合成。另一方面,AAA組織炎性細(xì)胞的浸潤增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性導(dǎo)致ECM的降解,進(jìn)而加劇AAA的發(fā)展。本實(shí)驗室首次發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)通過ASK-JNK-NONO信號通路直接抑制P4Hα1的活性,抑制膠原合成;并首次提出NONO蛋白參與動脈粥樣硬化(AS)的病理過程,同時通過與NF-κB p65蛋白相互作用調(diào)控AS的炎癥反應(yīng)。NONO(即人p54nrb)作為核蛋白,參與DNA損傷修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)及翻譯調(diào)控等基因調(diào)控過程,是一個多功能的高度保守蛋白。NONO蛋白作為cAMP信號通路的重要組成部分,調(diào)控cAMP下游TNF-α及白介素6(IL-6)的表達(dá)。一方面,NONO下調(diào)人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)及小鼠AS斑塊P4Hα1的表達(dá),抑制ECM合成;另一方面,NONO與NF-κB p65相互作用加劇AS的炎癥反應(yīng)并參與不穩(wěn)定斑塊的形成。這兩方面的作用均表明,NONO可能參與AAA的病理過程,而目前尚無相關(guān)研究。由此,我們推測通過NONO蛋白的敲減可能會通過增加膠原沉積及抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抑制AAA病理過程的作用。2研究目的(1)探索NONO在AAA中的分布及作用;(2)觀察NONO敲減后對AAA病理過程的影響;(3)探索NONO敲減對AAA的作用機(jī)制。3研究方法3.1分離并培養(yǎng)小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)將6周齡ApoE-/-雄性小鼠主動脈剝離后,剝?nèi)用}外膜及內(nèi)膜,冷PBS加1%青鏈霉素清洗三遍后,將血管用無菌維納斯剪成長度為1mm左右的動脈組織,在含20%胎牛血清(FBS)的高糖培養(yǎng)基(DMEM)中貼壁培養(yǎng),7天后換液。第3～9代的小鼠原代VSMCs用于本實(shí)驗研究。3.2小干擾RNA(siRNA)及干擾慢病毒的制備無義序列的小干擾RNA(si-NC)作為陰性對照,NONO干擾序列的小干擾RNA(si-NONO)如下:CCCACCAACAACTGAACGTTTCTCGAGAAACGTTCA GTTGTTGGTGGG。利用含有 pHelper 1.0 和 pHelper 2.0 的 siRNA 表達(dá)載體,在293T細(xì)胞中構(gòu)建慢病毒(LV)。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-RNA48小時后,收集病毒上清并將其通過0.45孔徑的醋酸纖維素針式過濾器過濾。通過對293T細(xì)胞GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選分析,檢測病毒載體的滴度。按照病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)=100的比例,利用NONO干擾慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs。病毒轉(zhuǎn)染3天后收集細(xì)胞蛋白檢測轉(zhuǎn)染效率或用于不同實(shí)驗研究。3.3動物造模8周齡ApoE-/-雄性小鼠購于北京維通利華動物實(shí)驗中心,遵循山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會要求飼養(yǎng)小鼠并造模。在22℃室溫12h白天/12h黑夜齊魯醫(yī)院心血管實(shí)驗室動物中心高脂(0.25%膽固醇加15%可可脂)喂養(yǎng)小鼠。本實(shí)驗共包括三個部分:第一部分:20只8周齡ApoE-/-雄性小鼠隨機(jī)分為對照組(n=10)和AAA組(n=10)。高脂喂養(yǎng)4周后對照組小鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周獲得對照組模型;AAA組小鼠通過高脂喂養(yǎng)4周后皮下埋入滲透泵(Alzet model 2004)泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周獲得小鼠AAA組。用以檢測小鼠AAA組織中NONO蛋白的表達(dá)量。第二部分:20只8周齡ApoE-/-雄性小鼠隨機(jī)分為以下四組。無尾靜脈注射慢病毒且無Ang Ⅱ泵注高脂喂養(yǎng)4周后取材(n=5);高脂喂養(yǎng)初期尾靜脈注射sh-NC慢病毒(2 × 107TU/只)并高脂喂養(yǎng)4周后取材(n=5);高脂喂養(yǎng)初期尾靜脈注射sh-NC慢病毒(2 × 107 TU/只)并高脂喂養(yǎng)4周后皮下埋入滲透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)2周后取材(n=5);高脂喂養(yǎng)初期尾靜脈注射sh-NC慢病毒(2 × 107 TU/只)并高脂喂養(yǎng)4周后皮下埋入滲透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周后取材(n=5)時取材,均用于檢測GFP熒光強(qiáng)度,明確轉(zhuǎn)染效率。第三部分:100只8周齡ApoE-/-雄性小鼠隨機(jī)分為對照組(n=25)、Ang Ⅱ組(NT 組,n=25)、Ang Ⅱ+sh-NC 組(sh-NC 組,n=25)、以及 Ang Ⅱ+sh-NONO組(sh-NONO組,n=25)。其中,對照組小鼠無尾靜脈注射慢病毒且無Ang Ⅱ泵注高脂喂養(yǎng)8周后取材;NT組于高脂喂養(yǎng)初期尾靜脈注射0.9%生理鹽水4周后皮下埋入滲透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周后取材,sh-NC組于高脂喂養(yǎng)初期尾靜脈注射sh-NC(2 × 107TU/只)的陰性對照慢病毒4周后皮下埋入滲透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周后取材,sh-]NO]NO組于高脂喂養(yǎng)初期尾靜脈注射sh-NONO(2 × 107 TU/只)的干擾慢病毒4周后皮下埋入滲透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4 周后取材。3.4小鼠體重及血脂水平的檢測分別于實(shí)驗前及試驗結(jié)束時稱量ApoE-/-小鼠體重。左室心尖部抽血留取血清,分別檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)的血脂水平。3.5血壓測量分別于實(shí)驗前及試驗結(jié)束時,通過尾靜脈測量ApoE-/-小鼠血壓。每只小鼠血壓測量三次取平均值。3.6AAA測量留取小鼠全長主動脈,置于4%多聚甲醛過夜保存。大體顯微鏡下剝離主動脈外膜多余的結(jié)締組織及脂肪組織,拍照記錄。通過Image-Pro Plus 6.0測量動脈最大直徑以測量瘤體大小。AAA是以主動脈直徑增加150%,或任何瘤體內(nèi)出血(含直徑增加僅110%)。AAA的嚴(yán)重度分級包括:None,無動脈瘤;Ⅰ型,管腔擴(kuò)張但無腔內(nèi)血栓形成;Ⅱ型,管腔擴(kuò)張伴腔內(nèi)血栓形成;Ⅲ型,明顯的管腔擴(kuò)張但無腔內(nèi)血栓形成;Ⅳ型多發(fā)動脈瘤伴血栓,部分動脈瘤重疊。兩名研究者進(jìn)行統(tǒng)計分析。3.7主動脈組化分析石蠟包埋主動脈弓至腎動脈的組織,在主動脈直徑最大部分利用石蠟切片機(jī)進(jìn)行5μm連續(xù)切片用于組織化學(xué)染色。蘇木素-伊紅染色(HE染色)用于評估AAA形態(tài);Verhoeff染色用于觀察AAA彈力纖維的完整性:Masson染色及天狼猩紅染色用于檢測AAA膠原含量;組化染色分別檢測巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、膠原Ⅰ(CI)、膠原Ⅲ(CⅢ)、P4Hα1、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、白介素1β(IL-1β)、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP-1)、白介素6(IL-6)及TNF-α的表達(dá)量,IgG作為組化染色的陰性對照,所有組化染色結(jié)果利用Image J軟件統(tǒng)計分析。3.8細(xì)胞培養(yǎng)含20%胎牛血清的高糖DMEM用于培養(yǎng)原代小鼠VSMCs。首先,1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ用于刺激VSMCs模擬AAA,收集細(xì)胞蛋白檢測NONO表達(dá)量;然后,通過MOI=100的病毒復(fù)染指數(shù)轉(zhuǎn)染VSMCs分別轉(zhuǎn)染sh-NC及sh-NONO病毒,三天后加入1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激VSMCs進(jìn)行體外實(shí)驗研究。所有實(shí)驗結(jié)果至少重復(fù)三次。3.9 Western Blot 檢測ApoE-/-雄性小鼠主動脈或VSMCs提取組織蛋白或細(xì)胞蛋白用于Western blot實(shí)驗。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉非特異性抗原、孵育對應(yīng)的一抗及二抗、辣根過氧化物酶發(fā)光顯影等操作,檢測NONO、CⅠ、CⅢ、P4Hαl、MMP2、MMP9、IL-lβ、MCP-1、TNF-α 磷酸化NF-κB p65(p-p65)及總NF-κB p65(t-p65)的蛋白表達(dá)量,GAPDH作為western blot的內(nèi)參以證實(shí)蛋白上樣量一致。3.10細(xì)胞免疫共沉淀(co-IP)將VSMCs種于150 mm2培養(yǎng)皿中,在細(xì)胞密度達(dá)80%-90%后血清饑餓細(xì)胞24h,加入1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激1h,提取蛋白進(jìn)行免疫共沉淀。分別用NONO一抗或NF-κB p65一抗孵育的蛋白A/G瓊脂糖珠拉取NONO蛋白及NF-κB p65蛋白,IgG為陰性對照。通過western blot技術(shù)檢測結(jié)合蛋白。3.11細(xì)胞免疫熒光檢測1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激80%密度的VSMCs細(xì)胞爬片1h后,通過甲醛固定、Triton破膜、5%BSA封閉非特異性抗原、孵育NONO及NF-κB p65一抗、相對應(yīng)的熒光二抗、DAPI染色及熒光共聚焦顯影,檢測NONO及NF-κB p65的共定位。3.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用SPSS v19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。通過獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行兩兩比較;單因素方差分析用于滿足方差齊性假設(shè)的多組比較;非參數(shù)齊性檢測用于多因素比較�？ㄆ仗m-邁耶曲線(生存率曲線)用于小鼠生存狀態(tài)的統(tǒng)計分析。P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4研究結(jié)果4.1 NONO蛋白在ApoE--小鼠AAA組織及Ang Ⅱ刺激的VSMCs中的表達(dá)與正常主動脈組織相比,ApoE-/-小鼠AAA組織中NONO蛋白的表達(dá)量明顯增加(P0.05);與正常VSMCs相比,Ang Ⅱ刺激后VSMCs中NONO蛋白的表達(dá)量明顯增加(P0.05)。小鼠AAA組織熒光共定位染色顯示,NONO蛋白在巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá),且無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。4.2慢病毒在體內(nèi)及體外的轉(zhuǎn)染效率檢測分別于ApoE-/-小鼠尾靜脈注射sh-NC慢病毒4周、6周及8周時,通過檢測小鼠主動脈GFP熒光強(qiáng)度明確小鼠體內(nèi)慢病毒的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示三個不同的時間節(jié)點(diǎn)取材獲得的小鼠主動脈均觀察到GFP的綠色熒光。Sh-NONO慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠后,AAA組織中NONO蛋白表達(dá)量下調(diào)約50%(P0.01)。Sh-NONO慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs后,小鼠原代平滑肌細(xì)胞中NONO蛋白表達(dá)量下調(diào)超過50%(P0.01)。4.3四組ApoE-/-小鼠的血脂及血壓水平本實(shí)驗第三部分的四組ApoE-/-小鼠的血脂水平均無明顯差異。皮下泵注AngⅡ的小鼠收縮壓水平明顯升高,而NONO蛋白敲減組AAA造模小鼠的收縮壓較其他AAA造模小鼠的收縮壓無明顯差異。4.4降低NONO蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)Ang Ⅱ?qū)е碌腁poE-/-小鼠AAA的發(fā)生率第三部分實(shí)驗結(jié)果顯示,對照組小鼠無AAA的發(fā)生,而Ang Ⅱ?qū)е碌腁poE-/-小鼠AAA的發(fā)生率在NT組、sh-NC組及sh-NONO組分別為80%(P0.05)、84%(P0.05)及48%(P0.05)。根據(jù)AAA的嚴(yán)重度分級顯示,NT組及sh-NC組中Ⅲ型及Ⅳ型AAA 比例更高,而sh-NONO組中Ⅰ型及Ⅱ型AAA的比例較高。因此,降低NONO蛋白的表達(dá)量能夠明顯降低AAA的發(fā)生發(fā)展。此外,腹主動脈的最大直徑在Ang Ⅱ刺激ApoE-/-小鼠中明顯升高(P0.05),sh-NONO組腹主動脈的最大直徑顯著低于NT組(P0.05)及sh-NC組(P0.05),NT組及sh-NC組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。生存曲線顯示,Ang Ⅱ明顯降低小鼠的存活率。4.5降低NONO蛋白的表達(dá)對AAA組織及形態(tài)的影響HE及Verhoeff染色顯示,Ang Ⅱ刺激ApoE-/-、鼠導(dǎo)致AAA的病理過程中出現(xiàn)主動脈外膜病理性膨大、中膜結(jié)構(gòu)損壞及彈力纖維斷裂等。慢病毒敲減NONO蛋白后,上述病理性改變較NT組及sh-NC組明顯減輕;而NT組及sh-NC組的血管病理性形態(tài)改變無明顯差異。此外,sh-NONO組小鼠AAA組織中動脈壁膠原含量、平滑肌細(xì)胞含量明顯升高(P0.05),巨噬細(xì)胞含量明顯下降(P0.01);而NT組及sh-NC組的血管中的膠原含量及細(xì)胞組成成分的改變無明顯差異。4.6降低NONO蛋白的表達(dá)對膠原沉積和膠原降解的影響免疫組化及天狼猩紅染色結(jié)果顯示,相比NT組及sh-NC組的AAA組織,敲減 NONO 蛋白能夠顯著增加 P4Hα1(P0.01)、CI(P0.01)和 CⅢ(P0.01)的表達(dá)量及天狼猩紅陽性率(P0.01),同時顯著降低MMP2(P0.01)、MMP9(P0.01)的表達(dá)量;而上述指標(biāo)在NT組及sh-NC組的AAA組織無明顯差異。Ang Ⅱ刺激VSMCs 24h提取細(xì)胞蛋白的Western Blot結(jié)果顯示,相比NT組及sh-NC組的VSMCs,敲減NONO蛋白能夠顯著增加CI(P0.01)、CⅢ(P0.01)及P4Hα1(P0.01)的蛋白表達(dá)量,同時顯著降低MMP2(P0.01)、MMP9(P0.05)的表達(dá)量。4.7降低NONO蛋白的表達(dá)對炎性因子浸潤的影響免疫組化染色結(jié)果顯示,相比NT組及sh-NC組的AAA組織,敲減NONO蛋白能夠顯著降低 IL-1β(P0.01)、MCP-1(P0.01)、IL-6(P0.01)和 TNF-α(P0.01)的表達(dá);而上述指標(biāo)在NT組及sh-NC組的AAA組織無明顯差異。Ang Ⅱ刺激VSMCs 24h提取細(xì)胞蛋白的Western Blot結(jié)果顯示,相比NT組及sh-NC組的VSMCs,敲減NONO蛋白能夠顯著抑制IL-1β(P0.01)、MCP-1(P0.01)和TNF-α(P0.01)的表達(dá)。4.8降低NONO蛋白的表達(dá)對NF-κB p65核轉(zhuǎn)位及磷酸化水平的影響轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65作為AS的重要調(diào)控因子,參與調(diào)控炎癥因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表達(dá)水平。通過細(xì)胞免疫共沉淀實(shí)驗,發(fā)現(xiàn)NONO蛋白與NF-κB p65在Ang Ⅱ刺激后能夠相互結(jié)合。熒光染色結(jié)果顯示,NONO蛋白敲減能夠顯著抑制Ang Ⅱ刺激導(dǎo)致的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位,IgG為陰性對照。同時,NONO蛋白敲減能夠顯著抑制Ang Ⅱ刺激導(dǎo)致的NF-κB p65的磷酸化水平(P0.01)。5結(jié)論(1)通過慢病毒敲減ApoE-/-小鼠NONO蛋白的表達(dá)量,可通過增加膠原沉積、抑制炎癥反應(yīng),抑制Ang Ⅱ?qū)е碌男∈驛AA的形成;(2)敲減NONO蛋白可能通過抑制NF-κB p65的磷酸化水平發(fā)揮對AAA的有益作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R543
【部分圖文】：

?ｉ???ＣＣＫ８、細(xì)胞闊期檢測、?ｑＲＴ－ＰＣ’Ｒ檢測：?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測：?信號通路的檢測：??Ｔｒａｕｓｗｅｌｌ小室、細(xì)胞到痕實(shí)驗、ＮＯＮＯ、ＰＳＰＣ１、ＳＦＰＱ、?Ｎ〇Ｎ〇、ｐＳＰｎ、ＳＦＰｑ、ｐＣＮＡ、?ＮＯＮＯ?＋?Ｅｒｋｌ，＿＿２的??｜?ＩＦ：?ＮＯＮＯ＋Ｅｒｉｃｌ／２?ＰＣＮＡ－?ｐ２Ｋ?ＳＭ２２ａ．?ｐ：Ｋ?Ｓ＼Ｉ：２ａ，?ａ－ＳＭＡ，?ｐ－ＭＥＫｌ、｜?Ｉ?蛋白互作—??ａ－ＳＭＡ???ｔ－ＭＥＫｌ、ｐ－Ｅｉｋｌ，２、ｔ－Ｅｉｋｌ／２??圖２．體外實(shí)驗流程圖??ＶＳＭＣ：血管平滑肌細(xì)胞；ＫＯ：敲除。??５１??

ＴＣｏｎｔｒｏｌＷＴＬＪｇａｔｉｏｎ?ＩｇＧ?Ｅ?Ｆ?６??＿?！Ｉｉｊ?｜ｕ??ｈ?§ｕ?ｉ〇??Ｈ?ＨＡＳＭＣ??ＰＤＧＦ－昍＝ＺＩＺ?Ｓ１５１?．￣�。。�?Ｊｉｓ，?．．．??ＮＯＮＯ?－?－－?５４ＫＤａ??ＧＡＰＯＨ???３７ＫＤａ?Ｉ卜?ｌ卜??■■■?ｐ〇ｃ，ｂｂ＾ｃ?ｍｍ?Ｂ?ｍｍＭ??ＮＯＮＯ?５４?ＫＤａ?°?０?０?ＨＡＳＭＣ?ＨＡＳＭＣ＊ＰＤＧＦ－８Ｂ?ｗｔ?ｓｍｃ?ｗｔ?ｓｍｃ＊ｐｄｇｆ－８ｂ??ＧＡＰＤＨ?－?—?－３７?ＫＤａ??圖４．?ＮＯＮＯ蛋白主要分布在平滑肌細(xì)胞內(nèi)??Ａ：免疫熒光檢測ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ在人正常和狹窄冠脈組織的表達(dá)，圖中黃色??箭頭標(biāo)不ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ的共定位，Ｌ標(biāo)不血營管ｆｅ，標(biāo)尺＝５０?｜ｊｍ；?Ｂ：免疫??熒光檢測ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ仵人狹窄冠脈組織的表達(dá)，閣屮黃色箭頭杬示ＮＯＮＯ??和ＳＭ２２ａ的共定位，Ｌ、Ｍ、Ｉ分別標(biāo)示血管管腔、中膜、內(nèi)膜，標(biāo)尺＝５０?ｐｍ；??Ｃ：免疫熒光檢測ＮＯＮＯ和ＣＤ６８在人狹窄冠脈姐織的表達(dá)，閣屮黃色箭頭標(biāo)示??ＮＯＮＯ和ＣＤ６８的共定位，Ｌ標(biāo)示血管管腔，標(biāo)尺＝５０｜＿ｉｍ；?Ｄ：免疫熒光檢測??ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ、ＣＤ３１、ＣＤ６８在小鼠ｉＨ常和結(jié)扎后的頸動脈屮的ＪＩ：表達(dá)，圖??中黃色箭頭標(biāo)示ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ?（上）、ＮＯＮＯ和ＣＤ３１?（屮）、ＮＯＮＯ和ＣＤ６８??（下）的共定位，標(biāo)尺＝Ｅ：小鼠正常和結(jié)扎后的頸動脈ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ??的共定位分析，Ｎ＝５／組；Ｆ：小鼠正常和結(jié)扎后的頸動脈ＮＯＮＯ和ＣＤ３１的共定??位分析，Ｎ＝５／組；Ｇ：小鼠正常和結(jié)扎后的頸動脈ＮＯＮＯ和ＣＤ６８的共定位分

慢病毒ＮＯＮＯ組；ＡＡＡ：股丨？：動脈瘤；ＷＢ：蛋白印跡；ｍｅ：免疫組化染色。??ＡｐｏＥ?背苽?ＷＴＶＳＭＣｓ??Ｎｏ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ＾１１?Ｓｈ－ＮＣ組?Ｓｌｉ－ＮＯＮＯ組??？?ＷＢ：?Ｃｏｌｌａｇｅｎ?Ｉ?％?Ｃｏｌｌａｇｅｎ?ＵＫ?Ｐ４ＨａＫ?ＭＭＰ２＾?ＭＭＰ９＞??ＩＬ－ｉｐ＞?ＭＣＰ－Ｋ?ＴＮＦ－ａｖ?ｐ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５．?ｔ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５??？?Ｃｏ－ＩＰ：?ＮＯＮＯ＋ｔ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５??？免疫熒光染色：ＮＯＮＯ＋ｔ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５??圖２．體外實(shí)驗流程圖??ＶＳＭＣ：血管平滑肌細(xì)胞；Ｎｏ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ組：生理鹽水組；Ｓｈ－ＮＣ組：干擾慢病毒陰性對照；??Ｓｈ－ＮＯＮＯ組：干擾慢病毒ＮＯＮＯ組；ＷＢ：蛋白印跡；Ｃｏ－ＩＰ：免疫共沉淀。??１０７??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Ning Shi;Shi-You Chen;;Mechanisms simultaneously regulate smooth muscle proliferation and differentiation[J];The Journal of Biomedical Research;2014年01期

本文編號：2866982