本文關(guān)鍵詞：PD-1:B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細胞功能和表型及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的膿毒癥是病情進展迅速的危重疾病,是戰(zhàn)創(chuàng)傷、休克及手術(shù)后常見的并發(fā)癥。膿毒癥及其引起的多器官功能障礙是ICU患者死亡的重要因素,目前臨床上尚無特異性治療手段。巨噬細胞是天然免疫的重要組成部分,在炎癥啟動和病原清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞功能障礙伴隨著膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。在感染的初始階段,巨噬細胞在各種外來物質(zhì)的刺激下過度活化,產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),進而招募激活中性粒細胞,導致系統(tǒng)性全身炎癥反應綜合征。此外,巨噬細胞通過分泌細胞因子,攝取遞呈抗原,從而激活淋巴細胞功能,協(xié)同啟動獲得性免疫反應。在膿毒癥中,巨噬細胞過度活化后,會進入功能抑制狀態(tài),表現(xiàn)為吞噬功能低下,分泌細胞因子能力降低。近年來研究發(fā)現(xiàn),共抑制分子程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)/程序性死亡受體配體-1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)信號通路與膿毒癥免疫耐受密切相關(guān)。通過PD-1或B7H1基因缺陷的小鼠發(fā)現(xiàn),阻斷PD-1:B7H1信號通路可以減輕膿毒癥引起的臟器損傷,降低血漿炎癥因子,增強細菌清除能力,從而改善小鼠的生存期。值得注意的是,在膿毒癥中,PD-1和B7H1基因缺陷的小鼠腹腔巨噬細胞功能較野生型小鼠有明顯改善,表現(xiàn)為感染局部的數(shù)量增多,產(chǎn)生的細胞因子增多;PD-1敲除小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能明顯高于野生型膿毒癥小鼠。在膿毒癥患者的研究中發(fā)現(xiàn),通過抗PD-L1抗體體外阻斷PD-1:B7H1通路,可以改善患者外周血單核細胞的功能,促進其分泌更多的炎癥因子。綜上,PD-1:B7H1通路在膿毒癥時巨噬細胞功能障礙中可能發(fā)揮重要的作用,且PD-1基因缺陷或B7H1基因缺陷后對巨噬細胞功能的影響可能有不同之處。PD-1:B7H1在巨噬細胞上表達受何調(diào)控,對巨噬細胞的功能和表型有何調(diào)節(jié)作用目前尚不明確。本課題擬首先利用PD-1基因缺陷和B7H1基因缺陷小鼠,分別通過培養(yǎng)骨髓來源巨噬細胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM)和腹腔巨噬細胞(Peritoneal macrophage,PM),研究巨噬細胞分泌細胞因子,抗原遞呈相關(guān)分子的表達,細胞極化以及吞噬功能的影響及其機制。最后利用PD-1和PD-L1基因敲除小鼠,在體觀察基因缺陷后對巨噬細胞活化和表型的影響,并進一步研究其在膿毒癥模型中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。實驗對象及方法1、周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只,處死后收集股骨和脛骨骨髓腔細胞,給予M-CSF集落刺激因子共培養(yǎng),體外培養(yǎng)7d后獲得骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)。周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只,給予腹腔注射1ml3%巰基乙酸鹽,4天后灌洗腹腔,收集腹腔巨噬細胞(PM)。標記F4/80抗體后,流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞純度。2、對培養(yǎng)成熟的BMDM及腹腔來源的PM,給予不同濃度的LPS刺激24h后,收集上清,ELISA檢測細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達水平;周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各6只,給予腹腔注射5mg/kg LPS,8h后處死小鼠,收集外周血及腹腔灌洗液,ELISA檢測細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達水平。3、對培養(yǎng)成熟的BMDM及PM計數(shù)鋪板后,給予LPS或IFN-γ刺激24h,流式細胞術(shù)檢測CD80、CD86、CD40和MHC-II分子的表達;將培養(yǎng)成熟的BMDM分為對照組和IFN-γ刺激組,western-blotting檢測細胞STAT-1和STAT-3的磷酸化水平。4、周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各12只,隨機均分為對照組和CLP組,流式細胞術(shù)分別檢測腹腔巨噬細胞和脾臟巨噬細胞(Splenic macrophage,SM)表面CD80、CD86、CD40和MHCII分子的表達;收集各組naive小鼠外周血,ELISA檢測血漿中IFN-γ和IL-12p70的水平;收集各組naive小鼠的腹腔巨噬細胞,western-blotting檢測STAT-4的磷酸化水平。5、對培養(yǎng)成熟的BMDM計數(shù)鋪板后,給予IFN-γ或IL-4刺激24h后,分別收集總RNA和細胞蛋白,使用實時定量熒光PCR和western blotting檢測巨噬細胞極化相關(guān)分子i-NOS、Arginase、CD206和YM-1的m RNA和蛋白表達6、對培養(yǎng)成熟的BMDM或PM計數(shù)鋪板后,分為對照組和LPS刺激組,加入熒光標記的大腸桿菌1h后,流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞的吞噬能力。結(jié)果1、利用野生型小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠培養(yǎng)獲得的BMDM和PM,生長狀態(tài)良好,純度達到80-95%。2、給予低濃度LPS(1ng/ml)刺激時,從PD-1-/-和B7H1-/-小鼠來源的BMDM和PM分泌的細胞因子高于野生型小鼠;當給予高濃度LPS(100ng/ml)刺激時,基因缺陷小鼠來源的巨噬細胞分泌的細胞因子與野生型小鼠組沒有明顯差異。給予非致死劑量的LPS刺激后,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達水平均高于野生型小鼠;基因缺陷小鼠的腹腔灌洗液中IL-6和IL-12p70表達水平高于野生型小鼠,TNF-α和IL-10的表達水平過低,檢測不出。3、B7H1-/-組BMDM表面CD80和MHC-II表達水平低于野生型對照組,在LPS或IFN-γ刺激后,CD80表達水平仍然顯著低于野生型對照組;B7H1-/-組PM表面MHC-II表達水平顯著高于野生型對照組。PD-1-/-組PM表面CD80、CD86和MHC-II表達水平顯著高于野生型對照組。PD-1-/-和B7H1-/-組巨噬細胞在IFN-γ刺激前后的STAT-1和STAT-3磷酸化水平與野生型組均無顯著差異。4、PD-1-/-和B7H1-/-組naive小鼠PM表達更高水平的MHC-II分子,PD-1-/-組PM和SM表面CD80表達水平高于野生型小鼠。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中IL-12p70表達水平高于野生型小鼠組,但IFN-γ的表達水平與野生型小鼠無明顯差異;PD-1-/-和B7H1-/-小鼠腹腔巨噬細胞的STAT-4磷酸化水平顯著高于野生型小鼠。與對照組相比,膿毒癥小鼠腹腔巨噬細胞表面CD86、CD40和MHC-II的表達顯著降低;脾臟巨噬細胞表面CD80的表達水平明顯升高;與野生型小鼠相比,PD-1-/-和B7H1-/-組膿毒癥小鼠表達相當水平的抗原遞呈相關(guān)分子。5、與野生型小鼠組相比,PD-1-/-和B7H1-/-組BMDM在IFN-γ刺激后表達相當水平的i-NOS m RNA和蛋白;在IL-4刺激后,各組之間Arginase和YM-1的m RNA和蛋白表達均無差異,但B7H1-/-組表達更高水平的CD206蛋白。6、LPS預處理6h后,巨噬細胞的吞噬功能并無明顯變化;與野生型小鼠比,PD-1-/-和B7H1-/-組BMDM或PM在LPS刺激前后的吞噬功能均無顯著差異。結(jié)論PD-1:B7H1通路參與負性調(diào)節(jié)巨噬細胞在LPS刺激下細胞因子的分泌。PD-1或B7H1基因缺陷可以不同方式影響巨噬細胞的表面抗原遞呈相關(guān)分子的表達,其調(diào)節(jié)作用與巨噬細胞的來源和不同的刺激方式相關(guān)。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中表達明顯升高的IL-12p70,其可能通過STAT-4通路調(diào)節(jié)抗原遞呈相關(guān)分子的表達。PD-1:B7H1通路不直接影響巨噬細胞的極化和吞噬功能。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細胞 炎癥反應 抗原遞呈分子 細胞極化 吞噬功能
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 英文縮略詞對照表14-16
• 前言16-20
• 第一部分 PD-1：B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細胞活化后細胞因子的分泌20-35
• 引言20-21
• 一、材料與方法21-28
• 二、結(jié)果28-32
• 三、討論32-35
• 第二部分 PD-1：B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細胞抗原遞呈相關(guān)分子的表達35-64
• 引言35-37
• 一、材料與方法37-46
• 三、結(jié)果46-60
• 四、討論60-64
• 第三部分 PD-1：B7H1通路對巨噬細胞極化的影響64-76
• 引言64-66
• 一、材料與方法66-72
• 二、結(jié)果72-75
• 三、討論75-76
• 第四部分 PD-1：B7H1通路對巨噬細胞吞噬功能的影響76-81
• 引言76-77
• 一、材料與方法77-80
• 二、結(jié)果80
• 三、討論80-81
• 全文總結(jié)81-82
• 參考文獻82-89
• 綜述89-101
• 參考文獻96-101
• 在讀期間發(fā)表文章及參與科研工作101-103
• 參與申報課題103-104
• 致謝104-105

  本文關(guān)鍵詞：PD-1:B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細胞功能和表型及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：284926