本文關(guān)鍵詞：PD-1:B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能和表型及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的膿毒癥是病情進(jìn)展迅速的危重疾病,是戰(zhàn)創(chuàng)傷、休克及手術(shù)后常見的并發(fā)癥。膿毒癥及其引起的多器官功能障礙是ICU患者死亡的重要因素,目前臨床上尚無特異性治療手段。巨噬細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分,在炎癥啟動(dòng)和病原清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞功能障礙伴隨著膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。在感染的初始階段,巨噬細(xì)胞在各種外來物質(zhì)的刺激下過度活化,產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),進(jìn)而招募激活中性粒細(xì)胞,導(dǎo)致系統(tǒng)性全身炎癥反應(yīng)綜合征。此外,巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子,攝取遞呈抗原,從而激活淋巴細(xì)胞功能,協(xié)同啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)。在膿毒癥中,巨噬細(xì)胞過度活化后,會(huì)進(jìn)入功能抑制狀態(tài),表現(xiàn)為吞噬功能低下,分泌細(xì)胞因子能力降低。近年來研究發(fā)現(xiàn),共抑制分子程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)/程序性死亡受體配體-1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)信號(hào)通路與膿毒癥免疫耐受密切相關(guān)。通過PD-1或B7H1基因缺陷的小鼠發(fā)現(xiàn),阻斷PD-1:B7H1信號(hào)通路可以減輕膿毒癥引起的臟器損傷,降低血漿炎癥因子,增強(qiáng)細(xì)菌清除能力,從而改善小鼠的生存期。值得注意的是,在膿毒癥中,PD-1和B7H1基因缺陷的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能較野生型小鼠有明顯改善,表現(xiàn)為感染局部的數(shù)量增多,產(chǎn)生的細(xì)胞因子增多;PD-1敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯高于野生型膿毒癥小鼠。在膿毒癥患者的研究中發(fā)現(xiàn),通過抗PD-L1抗體體外阻斷PD-1:B7H1通路,可以改善患者外周血單核細(xì)胞的功能,促進(jìn)其分泌更多的炎癥因子。綜上,PD-1:B7H1通路在膿毒癥時(shí)巨噬細(xì)胞功能障礙中可能發(fā)揮重要的作用,且PD-1基因缺陷或B7H1基因缺陷后對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響可能有不同之處。PD-1:B7H1在巨噬細(xì)胞上表達(dá)受何調(diào)控,對(duì)巨噬細(xì)胞的功能和表型有何調(diào)節(jié)作用目前尚不明確。本課題擬首先利用PD-1基因缺陷和B7H1基因缺陷小鼠,分別通過培養(yǎng)骨髓來源巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM)和腹腔巨噬細(xì)胞(Peritoneal macrophage,PM),研究巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá),細(xì)胞極化以及吞噬功能的影響及其機(jī)制。最后利用PD-1和PD-L1基因敲除小鼠,在體觀察基因缺陷后對(duì)巨噬細(xì)胞活化和表型的影響,并進(jìn)一步研究其在膿毒癥模型中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)對(duì)象及方法1、周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只,處死后收集股骨和脛骨骨髓腔細(xì)胞,給予M-CSF集落刺激因子共培養(yǎng),體外培養(yǎng)7d后獲得骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)。周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只,給予腹腔注射1ml3%巰基乙酸鹽,4天后灌洗腹腔,收集腹腔巨噬細(xì)胞(PM)。標(biāo)記F4/80抗體后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞純度。2、對(duì)培養(yǎng)成熟的BMDM及腹腔來源的PM,給予不同濃度的LPS刺激24h后,收集上清,ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達(dá)水平;周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各6只,給予腹腔注射5mg/kg LPS,8h后處死小鼠,收集外周血及腹腔灌洗液,ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達(dá)水平。3、對(duì)培養(yǎng)成熟的BMDM及PM計(jì)數(shù)鋪板后,給予LPS或IFN-γ刺激24h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD80、CD86、CD40和MHC-II分子的表達(dá);將培養(yǎng)成熟的BMDM分為對(duì)照組和IFN-γ刺激組,western-blotting檢測(cè)細(xì)胞STAT-1和STAT-3的磷酸化水平。4、周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各12只,隨機(jī)均分為對(duì)照組和CLP組,流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞(Splenic macrophage,SM)表面CD80、CD86、CD40和MHCII分子的表達(dá);收集各組naive小鼠外周血,ELISA檢測(cè)血漿中IFN-γ和IL-12p70的水平;收集各組naive小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,western-blotting檢測(cè)STAT-4的磷酸化水平。5、對(duì)培養(yǎng)成熟的BMDM計(jì)數(shù)鋪板后,給予IFN-γ或IL-4刺激24h后,分別收集總RNA和細(xì)胞蛋白,使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR和western blotting檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子i-NOS、Arginase、CD206和YM-1的m RNA和蛋白表達(dá)6、對(duì)培養(yǎng)成熟的BMDM或PM計(jì)數(shù)鋪板后,分為對(duì)照組和LPS刺激組,加入熒光標(biāo)記的大腸桿菌1h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。結(jié)果1、利用野生型小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠培養(yǎng)獲得的BMDM和PM,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,純度達(dá)到80-95%。2、給予低濃度LPS(1ng/ml)刺激時(shí),從PD-1-/-和B7H1-/-小鼠來源的BMDM和PM分泌的細(xì)胞因子高于野生型小鼠;當(dāng)給予高濃度LPS(100ng/ml)刺激時(shí),基因缺陷小鼠來源的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與野生型小鼠組沒有明顯差異。給予非致死劑量的LPS刺激后,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達(dá)水平均高于野生型小鼠;基因缺陷小鼠的腹腔灌洗液中IL-6和IL-12p70表達(dá)水平高于野生型小鼠,TNF-α和IL-10的表達(dá)水平過低,檢測(cè)不出。3、B7H1-/-組BMDM表面CD80和MHC-II表達(dá)水平低于野生型對(duì)照組,在LPS或IFN-γ刺激后,CD80表達(dá)水平仍然顯著低于野生型對(duì)照組;B7H1-/-組PM表面MHC-II表達(dá)水平顯著高于野生型對(duì)照組。PD-1-/-組PM表面CD80、CD86和MHC-II表達(dá)水平顯著高于野生型對(duì)照組。PD-1-/-和B7H1-/-組巨噬細(xì)胞在IFN-γ刺激前后的STAT-1和STAT-3磷酸化水平與野生型組均無顯著差異。4、PD-1-/-和B7H1-/-組naive小鼠PM表達(dá)更高水平的MHC-II分子,PD-1-/-組PM和SM表面CD80表達(dá)水平高于野生型小鼠。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中IL-12p70表達(dá)水平高于野生型小鼠組,但I(xiàn)FN-γ的表達(dá)水平與野生型小鼠無明顯差異;PD-1-/-和B7H1-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的STAT-4磷酸化水平顯著高于野生型小鼠。與對(duì)照組相比,膿毒癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面CD86、CD40和MHC-II的表達(dá)顯著降低;脾臟巨噬細(xì)胞表面CD80的表達(dá)水平明顯升高;與野生型小鼠相比,PD-1-/-和B7H1-/-組膿毒癥小鼠表達(dá)相當(dāng)水平的抗原遞呈相關(guān)分子。5、與野生型小鼠組相比,PD-1-/-和B7H1-/-組BMDM在IFN-γ刺激后表達(dá)相當(dāng)水平的i-NOS m RNA和蛋白;在IL-4刺激后,各組之間Arginase和YM-1的m RNA和蛋白表達(dá)均無差異,但B7H1-/-組表達(dá)更高水平的CD206蛋白。6、LPS預(yù)處理6h后,巨噬細(xì)胞的吞噬功能并無明顯變化;與野生型小鼠比,PD-1-/-和B7H1-/-組BMDM或PM在LPS刺激前后的吞噬功能均無顯著差異。結(jié)論P(yáng)D-1:B7H1通路參與負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在LPS刺激下細(xì)胞因子的分泌。PD-1或B7H1基因缺陷可以不同方式影響巨噬細(xì)胞的表面抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá),其調(diào)節(jié)作用與巨噬細(xì)胞的來源和不同的刺激方式相關(guān)。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中表達(dá)明顯升高的IL-12p70,其可能通過STAT-4通路調(diào)節(jié)抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)。PD-1:B7H1通路不直接影響巨噬細(xì)胞的極化和吞噬功能。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 炎癥反應(yīng) 抗原遞呈分子 細(xì)胞極化 吞噬功能
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 英文縮略詞對(duì)照表14-16
• 前言16-20
• 第一部分 PD-1：B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化后細(xì)胞因子的分泌20-35
• 引言20-21
• 一、材料與方法21-28
• 二、結(jié)果28-32
• 三、討論32-35
• 第二部分 PD-1：B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)35-64
• 引言35-37
• 一、材料與方法37-46
• 三、結(jié)果46-60
• 四、討論60-64
• 第三部分 PD-1：B7H1通路對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響64-76
• 引言64-66
• 一、材料與方法66-72
• 二、結(jié)果72-75
• 三、討論75-76
• 第四部分 PD-1：B7H1通路對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響76-81
• 引言76-77
• 一、材料與方法77-80
• 二、結(jié)果80
• 三、討論80-81
• 全文總結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-89
• 綜述89-101
• 參考文獻(xiàn)96-101
• 在讀期間發(fā)表文章及參與科研工作101-103
• 參與申報(bào)課題103-104
• 致謝104-105

  本文關(guān)鍵詞：PD-1:B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能和表型及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：284926