【摘要】：目的:骨髓抑制主要表現(xiàn)為外周血中白細(xì)胞降低,是化療最常見的毒副反應(yīng)之一,進(jìn)而可引起身體機(jī)能狀態(tài)下降、抵抗力減弱、嚴(yán)重感染等嚴(yán)重不良反應(yīng)。根據(jù)我們前期已有的針灸抗骨髓抑制的研究基礎(chǔ),本研究以與骨髓造血細(xì)胞發(fā)育過程中影響造血干/祖細(xì)胞的生存、增殖和分化方向有關(guān)的Notch信號通路為切入點(diǎn),探討Notch信號通路上相關(guān)差異基因與針灸改善化療后不良反應(yīng),保護(hù)骨髓造血細(xì)胞、改善骨髓抑制、增加外周血白細(xì)胞的相關(guān)作用途徑及分子生物學(xué)機(jī)制;探討針刺與艾灸兩種療法在改善骨髓抑制,提升白細(xì)胞方面作用環(huán)節(jié)的異同。同時這一研究也可為針灸改善造血損傷類疾病提供新的治療方法和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法:選用清潔級,雄性昆明種(KM)小鼠40只,體重18±2g,小鼠在實(shí)驗(yàn)室中自由飼養(yǎng)3天后進(jìn)行植瘤(溫度20o~25oC,相對濕度60%左右)。在無菌操作臺上進(jìn)行操作,把所需物品放在無菌操作臺上紫外線燈照射30min。抽取生理鹽水13.8ml放入三角燒瓶中。左手持傳代鼠,右手對小鼠腹部碘伏消毒,用1ml注射器(5ml針頭)抽取腹水2.3ml,緩慢注入含13.8ml的生理鹽水的三角燒瓶中,輕輕混勻,達(dá)到7倍稀釋液。用1ml注射器(5ml針頭)抽取細(xì)胞稀釋液1ml,左手持鼠,右手先對40只小鼠左腋下碘伏消毒,再持注射器進(jìn)行腋下注射,過程中針頭先刺入皮下,再緩慢向左腋下方向推進(jìn),到達(dá)腋窩內(nèi)再緩慢注入用瘤細(xì)胞5×106/0.2ml細(xì)胞稀釋液,隨后邊推針邊旋轉(zhuǎn)針頭至90°出針,同時用無菌棉簽按壓針孔數(shù)秒,避免液體滲出,最后放開小鼠,手持其尾部放入鼠籠中,完成植瘤。接種7天后,對荷瘤小鼠進(jìn)行尾靜脈采血并查WBC總數(shù),挑選白細(xì)胞接近正常范圍,瘤體生長良好的荷瘤小鼠32只(體質(zhì)量22±2g、瘤體直徑0.8cm左右),隨機(jī)分為4組,8只/組,即荷瘤空白組,荷瘤模型組,荷瘤針刺組,荷瘤艾灸組;分籠飼養(yǎng),苦味酸對各組荷瘤小鼠進(jìn)行染色編號。荷瘤模型組,荷瘤針刺組,荷瘤艾灸組的小鼠1次性腹腔注射環(huán)磷酰胺(ctx)150mg/kg,停藥后4h模型即成,荷瘤空白組小鼠腹腔注入同等劑量的生理鹽水。各組荷瘤小鼠每次選取1只依次配對固定于自制鼠板上施以針刺和艾灸治療。荷瘤空白組,荷瘤模型組陪同固定不治療;荷瘤針刺組選取“大椎”、“膈俞”(雙)、“腎俞”(雙)、“足三里”(雙)選用江蘇無錫佳健牌美容毫針(規(guī)格:0.19cm×10mm,針柄20mm),采用管式進(jìn)針法直刺,進(jìn)針深度為3mm,留針6min。每日1次,連續(xù)5天;荷瘤艾灸組選取“大椎”、“膈俞”(雙)、“腎俞”(雙)、“足三里”(雙)選用特制美容艾條(規(guī)格:0.4cm×25cm)點(diǎn)燃后,高于荷瘤小鼠穴位皮膚2cm處固定每穴懸灸3min,每日1次,連續(xù)5天。荷瘤空白組,荷瘤模型組同步固定,但不予治療。從荷瘤小鼠注射ctx之前一直到治療5天后,每天早上定時、按編號順序?qū)⒚恐恍∈蟾钗察o脈采血,光學(xué)顯微鏡下檢測外周血白細(xì)胞計數(shù),治療5天后的第2天在干冰上取荷瘤小鼠雙側(cè)股骨和脛骨。課題組前期應(yīng)用小通量基因表達(dá)譜芯片初步篩選各組健康小鼠骨髓造血細(xì)胞中notch信號通路相關(guān)差異基因;由于一方面健康小鼠與荷瘤小鼠為同一批次,只是帶瘤體質(zhì)的不同,另一方面由于經(jīng)費(fèi)原因,故在前期篩選的基礎(chǔ)上,運(yùn)用免疫組化法對進(jìn)一步篩選不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞中notch信號通路相關(guān)差異基因蛋白表達(dá)情況;realtime-pcr法分析不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞中notch信號通路相關(guān)差異基因mrna的轉(zhuǎn)錄情況;western–blot法進(jìn)一步驗(yàn)證不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞中notch信號通路相關(guān)差異基因的蛋白表達(dá)量。闡釋調(diào)控ctx化療荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞中的notch信號通路是針灸減輕骨髓抑制、提升外周血白細(xì)胞等綜合作用的關(guān)鍵機(jī)制。結(jié)果:(1)“實(shí)驗(yàn)一”結(jié)果顯示,荷瘤小鼠從注射ctx后的第2天外周血白細(xì)胞即降低。與荷瘤空白組比,治療后第3天荷瘤模型組、荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞計數(shù)降至最低(p0.05),治療后第4天開始回升,與荷瘤模型組比,荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)回升幅度較大。治療后第5天,荷瘤模型組、荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)均已接近基礎(chǔ)白細(xì)胞水平,且與荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)高于荷瘤模型組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(2)“實(shí)驗(yàn)二”結(jié)果顯示,通過小通量基因表達(dá)譜芯片對健康小鼠進(jìn)行初步篩選,由于考慮小鼠來至同一整體,只是帶瘤體質(zhì)不同,故沒有對荷瘤小鼠進(jìn)行再次篩選,把篩選出的七個差異基因:notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2同樣作為差異基因進(jìn)行下一步研究。(3)“實(shí)驗(yàn)三”結(jié)果顯示,運(yùn)用免疫組化法對小通量基因表達(dá)譜芯片初步篩選出的荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞notch信號通路相關(guān)差異基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選,與荷瘤空白組比,荷瘤模型組中notch2和jag1、jag2蛋白表達(dá)含量降低,numb1和numb2蛋白表達(dá)含量升高,且具有顯著性差異(p0.05);delta1、notch1差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);與荷瘤模型組比,荷瘤針刺組與荷瘤艾灸組中notch2和jag1蛋白表達(dá)含量降低,numb1和numb2蛋白表達(dá)含量升高,且具有顯著性差異(p0.05);delta1、notch1、jag2差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。故最后確定將具有顯著性差異的jag1、notch2、numb1、numb2基因進(jìn)一步進(jìn)行研究。(4)“實(shí)驗(yàn)四”結(jié)果顯示,運(yùn)用rt-pcr法對荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞notch信號通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2的mrna轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測。與荷瘤空白組比,荷瘤模型組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),numb1、numb2蛋白表達(dá)含量降低,且numb2具有顯著性差異(p0.05);與荷瘤模型組比,荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量均有升高,numb1蛋白表達(dá)含量降低,但均無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);與荷瘤模型組比,荷瘤艾灸組numb2蛋白表達(dá)含量升高,具有顯著性差異(p0.05);與荷瘤針刺組比,荷瘤艾灸組numb2蛋白表達(dá)含量高于荷瘤針刺組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(5)“實(shí)驗(yàn)五”結(jié)果顯示,運(yùn)用western-blot法對荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞notch信號通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測。與荷瘤空白組比,荷瘤模型組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量升高且有顯著性差異(p0.05),numb1、numb2蛋白表達(dá)含量降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);與荷瘤模型組比,荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量均降低,且具有顯著性差異(p0.05),numb1、numb2蛋白表達(dá)含量升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);與荷瘤針刺組比,荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量均降低,numb1、numb2蛋白表達(dá)含量升高,差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但針刺有優(yōu)于艾灸的趨勢。結(jié)論:1.荷瘤小鼠白細(xì)胞基數(shù)比健康小鼠稍高。2.針刺和艾灸可以減輕ctx化療所致荷瘤小鼠骨髓抑制,提升外周血白細(xì)胞,其療效確切與導(dǎo)師組前期研究結(jié)果一致,治療后第3天降至最低,第4天開始回升,第5天達(dá)到正常,且荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)高于荷瘤模型組,針刺和艾灸兩種方法沒有顯著性差異。3.課題組前期應(yīng)用小通量基因表達(dá)譜芯片初步篩選各組正常小鼠骨髓造血細(xì)胞中notch信號通路相關(guān)差異基因;共篩選出七個差異基因:notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2。通過免疫組化法對小通量基因表達(dá)譜芯片初步篩選出的荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞notch信號通路7個差異基因進(jìn)一步篩選,確定jag1、notch2、numb1、numb2基因具有顯著性差異。4.通過對上述指標(biāo)的變化規(guī)律及相關(guān)性分析,闡釋針灸保護(hù)荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞,減輕骨髓抑制,提升白細(xì)胞數(shù)量與骨髓造血細(xì)胞notch信號通路相關(guān)基因和蛋白的分布及表達(dá)的關(guān)系,其關(guān)鍵機(jī)制可能是:對于ctx化療所致骨髓抑制,針灸可以通過上調(diào)荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞中notch信號通路上numb蛋白(numb1、numb2)的表達(dá),同時下調(diào)notch2、jagged1的蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制過度激活的notch信號通路,減輕因ctx化療引起的骨髓抑制。驗(yàn)證了“notch信號通路是針灸對抗骨髓抑制、改善造血等綜合作用的關(guān)鍵機(jī)制”之假說。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R245
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
前言
實(shí)驗(yàn)一 針灸對CTX化療荷瘤小鼠白細(xì)胞的影響
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 荷瘤小鼠模型復(fù)制及分組
            1.2.2 固定荷瘤小鼠方法
            1.2.3 荷瘤小鼠取穴及治療方法
            1.2.4 取材方法
            1.2.5 荷瘤小鼠白細(xì)胞檢測方法
            1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理
    2.結(jié)果
    3.討論
實(shí)驗(yàn)二 基因芯片篩選骨髓造血細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)差異基因
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 荷瘤小鼠模型復(fù)制及分組
            1.2.2 固定荷瘤小鼠方法
            1.2.3 荷瘤小鼠取穴及治療方法
            1.2.4 取材方法
            1.2.5 差異基因篩選
                1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)流程
                1.2.5.2 分析流程
                    1.2.5.2.1 iScan 激光掃描儀對熒光信號進(jìn)行掃描
                    1.2.5.2.2 Genomestudio 軟件讀取和導(dǎo)出原始信號值
                    1.2.5.2.3 差異基因表達(dá)判斷算法
                    1.2.5.2.4 結(jié)果目錄和分析流程
    2.結(jié)果
    3.討論
實(shí)驗(yàn)三 免疫組化法進(jìn)一步篩選荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)差異基因
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 荷瘤小鼠模型復(fù)制及分組
            1.2.2 固定荷瘤小鼠方法
            1.2.3 荷瘤小鼠取穴及治療方法
            1.2.4 取材方法
            1.2.5 差異基因免疫組化實(shí)驗(yàn)與檢測方法
                1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)流程
                1.2.5.2 檢測與分析方法
            1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理
    2.結(jié)果
    3.討論
實(shí)驗(yàn)四 RT-PCR法驗(yàn)證針灸對CTX荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)差異基因mRNA的影響
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 荷瘤小鼠模型復(fù)制及分組
            1.2.2 固定荷瘤小鼠方法
            1.2.3 荷瘤小鼠取穴及治療方法
            1.2.4 取材方法
            1.2.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)與檢測方法
                1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)流程
            1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理
    2.結(jié)果
    3.討論
實(shí)驗(yàn)五 Western blot法驗(yàn)證針灸對CTX荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)差異基因蛋白表達(dá)量的影響
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 荷瘤小鼠模型復(fù)制及分組
            1.2.2 固定荷瘤小鼠方法
            1.2.3 荷瘤小鼠取穴及治療方法
            1.2.4 取材方法
            1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)與檢測方法
                1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)流程
                1.2.5.2 檢測與分析方法
            1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理
    2.結(jié)果
    3.討論
討論
    1. 祖國醫(yī)學(xué)對惡性腫瘤化療所致骨髓抑制（白細(xì)胞減少癥）的認(rèn)識
    2.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對骨髓抑制（白細(xì)胞減少癥）及Notch信號通路的認(rèn)識
    3.結(jié)果與討論
    4.本研究創(chuàng)新點(diǎn)
結(jié)語
參考文獻(xiàn)
附錄1 綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄2
在校期間學(xué)術(shù)成績
致謝

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 曹大明;路玫;程艷婷;;扶正升白提取膏穴貼對化療小鼠造血和免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年02期

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3 李子禹;季鑫;季加孚;;新輔助化療對胃癌手術(shù)并發(fā)癥的影響[J];中國實(shí)用外科雜志;2013年04期

本文編號：2848166