第一部分大鼠腎臟足細(xì)胞的原代培養(yǎng)目的:通過(guò)原代培養(yǎng),獲得生物學(xué)特性更穩(wěn)定和更接近于體內(nèi)的足細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基本保證。方法:用高壓蒸汽滅菌的手術(shù)器械,從大鼠體內(nèi)分離腎臟,剝離腎被膜、分離腎臟皮質(zhì),然后用剪刀剪碎,分別以大小不同的篩網(wǎng)篩離(75、18目篩網(wǎng)),以DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮篩離的的腎小球,然后接種于培養(yǎng)瓶中(事先將Ⅰ型膠原包被在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁)。通過(guò)對(duì)大鼠腎臟足細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白進(jìn)行免疫熒光染色(WT-1和Synaptopodin蛋白),對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果:從大鼠腎臟分離腎小球后,培養(yǎng)第5天可見(jiàn)細(xì)胞克隆從腎小球周?chē)莱?這些細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出多邊形等上皮細(xì)胞的形態(tài),通過(guò)免疫熒光染色,WT-1和Synaptopodin蛋白均呈陽(yáng)性。結(jié)論:以差異過(guò)濾法分離腎小球,以WT-1和Synaptopodin作為鑒定足細(xì)胞的特異標(biāo)志蛋白,確認(rèn)得到原代培養(yǎng)的的大鼠足細(xì)胞。第二部分足細(xì)胞內(nèi)PPARγ的表達(dá)與定位目的:研究足細(xì)胞內(nèi)PPARγ的表達(dá)和定位。方法:分別以RT-PCR和Western blot方法,對(duì)大鼠足細(xì)胞PPARγm RNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)通過(guò)免疫組化染色觀察PPARγ在足細(xì)胞中的定位。在此基礎(chǔ)上,分別以羅格列酮10μM和吡格列酮1μM處理足細(xì)胞24小時(shí),檢測(cè)PPARγ在足細(xì)胞中的表達(dá)變化。為了進(jìn)一步檢測(cè)作為轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的生物學(xué)活性,以包含PPRE的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-PPRE和對(duì)照質(zhì)粒PRL-TK共同轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,檢測(cè)PPRE的熒光素酶活性。結(jié)果:經(jīng)RT-PCR檢測(cè),正常大鼠腎臟足細(xì)胞中表達(dá)PPARγ。以吡格列酮或羅格列酮分別處理足細(xì)胞,可見(jiàn)足細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)增加,與正常對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫組化染色顯示PPARγ陽(yáng)性染色位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和足突。吡格列酮和羅格列酮處理的足細(xì)胞,其PPRE熒光素酶活性增強(qiáng),與對(duì)照組相比,有顯著差別(P0.05)。結(jié)論:在大鼠腎臟足細(xì)胞有PPARγ表達(dá);吡格列酮和羅格列酮誘導(dǎo)PPARγ在足細(xì)胞的表達(dá),并增強(qiáng)其PPARγ轉(zhuǎn)錄活性。第三部分PPARγ激動(dòng)劑在TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原中的作用的實(shí)驗(yàn)研究目的:通過(guò)研究PPARγ激動(dòng)劑對(duì)TGFβ誘導(dǎo)的足細(xì)胞Ⅳ型膠原的表達(dá)影響,探討PPARγ激動(dòng)劑在足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原中的作用。方法:在TGFβ10ng/ml誘導(dǎo)24小時(shí)后,分別以羅格列酮10μM和吡格列酮1μM繼續(xù)處理24小時(shí),用ELISA方法檢測(cè)各組足細(xì)胞培養(yǎng)上清Ⅳ型膠原蛋白的濃度,同時(shí)用免疫熒光染色的方法觀察Ⅳ型膠原蛋白的熒光表達(dá)強(qiáng)度,之后以Ad-PPARγ-EGFP病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞或以GW9662處理各組足細(xì)胞24小時(shí),收集標(biāo)本檢測(cè)Ⅳ型膠原蛋白在各組中的表達(dá)水平。結(jié)果:足細(xì)胞培養(yǎng)上清Ⅳ型膠原蛋白濃度,在TGFβ組增加明顯,與Control組相比差異顯著(P0.01),而在TGFβ+Rosi組或TGFβ+Pio組則明顯減少,與TGFβ組相比差異顯著(P0.05)。足細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá),與Control組相比,Pio組或Ad-PPARγ組增加,其中Ad-PPARγ組與Ad-vecto組相比增加6倍。Ⅳ型膠原的免疫熒光強(qiáng)度在TGFβ組明顯增強(qiáng),而TGFβ+Pio組與Control組相比無(wú)明顯差別。足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原m RNA和蛋白水平在TGFβ組明顯增加,與Control組相比差異顯著(P0.05),而TGFβ+Rosi組或TGFβ+Pio組則明顯減少,與TGFβ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原蛋白表達(dá),在TGFβ+Ad-PPARγ組減少2-3倍,與TGFβ組相比,差異顯著(P0.05),而TGFβ+GW9662組表達(dá)明顯增加,且與Control組和TGFβ+Pio組相比,均有明顯差異(P0.05),TGFβ+Pio+GW9662組與Control組相比無(wú)明顯差別。結(jié)論:TGFβ誘導(dǎo)Ⅳ型膠原在足細(xì)胞中的表達(dá);PPARγ激動(dòng)劑或PPARγ在足細(xì)胞的過(guò)表達(dá)均可抑制Ⅳ型膠原蛋白的產(chǎn)生,而GW9662減弱了這種抑制作用。第四部分PPARγ激動(dòng)劑抑制TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞Ⅳ型膠原產(chǎn)生的機(jī)制研究目的:通過(guò)對(duì)TGFβ誘導(dǎo)下的P-Smad2/3蛋白表達(dá)和Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶活性變化的研究,探討Pio對(duì)TGFβ/Smad通路的影響,以及PPARγ激動(dòng)劑在TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原的機(jī)制。方法:以TGFβ10ng/ml誘導(dǎo)足細(xì)胞,給予或不給予Pio處理,分別在0、15、30min時(shí)用Western blot方法檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)P-Smad2/3蛋白表達(dá)的變化。以promoter軟件進(jìn)行啟動(dòng)子分析,對(duì)Ⅳ型膠原基因上的SBE進(jìn)行預(yù)測(cè),然后分別在各處理組細(xì)胞對(duì)此SBE序列的熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)P-Smad2/3蛋白的表達(dá)增加,并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn),TGFβ+Pio組細(xì)胞內(nèi)P-Smad2/3蛋白表達(dá)均減少,與TGFβ組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);TGFβ誘導(dǎo)下Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶活性增加,而TGFβ+Pio組和TGFβ+Rosi組其活性明顯下降,與TGFβ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為P0.01和P0.05)。結(jié)論:TGFβ可誘導(dǎo)磷酸化Smad2/3的表達(dá),并且是呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;PPARγ激動(dòng)劑抑制TGFβ所誘導(dǎo)的P-Smad2/3蛋白在足細(xì)胞中的表達(dá);PPARγ激動(dòng)劑使Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶的活性下降。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R692
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
常用縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表
前言
第一部分 大鼠腎臟足細(xì)胞的原代培養(yǎng)
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 腎小球分離
        2.2 腎小球和足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
        2.3 足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的免疫熒光染色
    3 分析與討論
    4 結(jié)論
第二部分 足細(xì)胞內(nèi)PPARγ 的表達(dá)及定位
    實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 各組足細(xì)胞PPARγ 的表達(dá)
        2.2 細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察PPARγ 在足細(xì)胞中的表達(dá)與定位
        2.3 吡格列酮和羅格列酮對(duì)大鼠足細(xì)胞內(nèi)PPRE熒光素酶活性的影響
    3 分析與討論
    4 結(jié)論
第三部分 PPARγ 激動(dòng)劑在TGFβ 誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原中的作用的實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 TGFβ 誘導(dǎo)下，羅格列酮和吡格列酮對(duì)足細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)的影響
        2.2 TGFβ 誘導(dǎo)下，Pio或PPARγ 的過(guò)表達(dá)對(duì)足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原表達(dá)的影響
        2.3 PPARγ 激動(dòng)劑Pio和PPARγ 抑制劑GW9662 對(duì)TGFβ 誘導(dǎo)的大鼠足細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)的影響
    3 分析與討論
    4 結(jié)論
第四部分 PPARγ 激動(dòng)劑抑制足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原的機(jī)制研究
    實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 TGFβ 以時(shí)間依賴方式上調(diào)P-Smad2/3 蛋白的表達(dá)及PPARγ 的作用
        2.2 分析預(yù)測(cè)COL Ⅳ 啟動(dòng)子上的SBE序列
        2.3 SBE熒光素酶活性的檢測(cè)結(jié)果
    3 分析與討論
    4 結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果
個(gè)人簡(jiǎn)歷

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 阮永華,張志剛,張秀榮,劉琛,郭慕依;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2在病變腎小球中的表達(dá)及其意義[J];中華病理學(xué)雜志;2002年04期

本文編號(hào)：2844909