一、研究背景肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床上常見的高致死率惡性腫瘤,5年死亡率超過90%,僅次于肺癌和胃癌。我國是HCC高發(fā)地區(qū),每年發(fā)病人數(shù)占全世界發(fā)病率50%。乙肝病毒(HBV)感染是HCC最主要的誘發(fā)因素之一,而我國HBV感染率高達58%,全國病毒攜帶者總數(shù)超過1億。因此,HBV誘發(fā)的肝細胞癌已成為我國最重要的公共健康問題之一。手術(shù)是治療HCC的首選方法。但是,由于診斷技術(shù)限制,80%的患者確診時通常已失去手術(shù)治療機會。因此,對于絕大多數(shù)HCC患者,安全有效的藥物治療極其重要。細胞色素P450酶(CYPs)和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是肝臟最主要的藥物代謝酶,廣泛參與了各種抗腫瘤藥物的代謝,從而影響腫瘤及癌旁正常細胞對藥物的敏感性。同時,這些代謝酶還參與了各種(前)致癌物質(zhì)的活化和滅活,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。多數(shù)抗腫瘤藥物在對腫瘤產(chǎn)生毒性作用的同時也會對正常組織造成損傷。臨床上使用這些藥物對HCC患者進行治療時很難預測藥物對腫瘤的殺傷效能及對周圍組織的毒副作用。其主要原因是代謝酶的個體差異及其在HCC疾病狀態(tài)下活性和表達的變化,造成了藥物在體內(nèi)動力學和藥效學的改變。因此,系統(tǒng)地闡明HCC狀態(tài)下CYPs和UGTs酶的表達及活性變化,對抗腫瘤藥物的合理使用及對治療效果的預估意義重大。另外,由于CYPs和UGTs酶的表達存在很大的個體差異,臨床上很難對每個患者肝組織中代謝酶的變化做出準確判斷。因此,建立靈敏便捷的定量檢測方法對個體中CYPs和UGTs酶的代謝能力進行監(jiān)控,對于HCC個體化治療具有重要意義。二、研究方法本研究共采集26例中低分化HCC患者肝組織樣本,對腫瘤組織和癌旁組織中CYPs和UGTs代謝酶的表達差異進行了系統(tǒng)研究。具體過程如下：采用差速離心法分別提取個體腫瘤組織及癌旁組織微粒體蛋白。建立LC-MS/MS蛋白定量方法,利用非同位素標記探針多肽對各樣本中7種CYPs亞型及5種UGTs亞型進行絕對定量,考察HCC腫瘤與癌旁組織中各種代謝酶的蛋白表達差異及其變化規(guī)律。建立肝微粒體體外代謝模型,采用探針底物法對HCC腫瘤組織及癌旁組織中7種CYPs酶代謝活性進行評價。同時,測定抗癌藥物索拉菲尼及替加氟在腫瘤及癌旁組織樣本中的酶代動力學參數(shù),考察HCC腫瘤組織對治療藥物處置能力的變化。提取HCC患者肝組織總RNA,采用Real-Time PCR方法研究腫瘤及癌旁組織中各CYPs亞型mRNA表達差異,闡明HCC腫瘤中CYPs蛋白及活性變化的初步原因,為進一步從轉(zhuǎn)錄水平研究其具體分子機制提供參考。三、實驗結(jié)果1.HCC腫瘤組織中CYPs和UGTs蛋白表達變化研究本研究建立了一種準確、穩(wěn)定、靈敏的LC-MS/MS方法可同時對人肝微粒體中7個CYPs和5個UGTs亞型進行絕對定量。利用這個方法,我們首次對HCC腫瘤組織及癌旁組織中CYPs和UGTs酶的蛋白絕對含量進行了測定。結(jié)果表明,與癌旁組織相比,80%以上患者腫瘤組織中CYPs蛋白表達水平顯著降低。其中CYP1A2平均蛋白表達降低了20倍(34.4±14.3 vs 1.8±1.6 pmol/mg microsomal protein),CYP3A4(34.8±16.5 vs 5.5±8.9)、2D6(13.9±9.0 vs 3.8 ±2.6)、2C8(56.0±26.9 vs 6.1±5.1)、2C9(85.0±35.4 vs 8.4±9.0)和2E1(30.0±13.0 vs 7.7±11.8)降低了4-10倍,而CYP2A6僅降低了2倍(12.3±8.5 vs 6.5±17.1)。對UGTs酶蛋白定量結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,腫瘤組織中UGT1A1 (23.1±8.4 vs 9.1±8.4 pmol/mg microsomal protein)、1A4 (56.5±36.0 vs 13.5± 16.2)、1A9 (24.4±19.1 vs 13.3±11.8)、2B7 (37.2±26.4 vs 5.6±8.2)蛋白表達顯著降低2-7倍。但是,UGT1A6表達并未下調(diào)(14.7±10.2 vs 23.1±21.8,p0.05),其蛋白表達僅在20%的腫瘤中降低,而在50%患者腫瘤組織中顯著升高。提示UGT1A6可能與HCC腫瘤細胞耐藥機制有關(guān)。另外,UGT1A6還可能作為HCC治療的新靶點,為代謝酶相關(guān)治療藥物開發(fā)提供新思路。在正常人肝微粒體中(rHLMs-pooled), CYP2E1蛋白表達水平最高(30%),其次為CYP2C9 (21%)和CYP2C8 (14%)。 CYP3A4和CYP2D6是CYPs家族中最重要的兩個亞型,參與了市場上50%藥物代謝。但是,其蛋白表達比例僅為14%和5%。正常人肝微粒體中UGTs家族各亞型蛋白表達量差異較小。其中CYP1A4表達最高(占29%)。而主要參與藥物等外源性物質(zhì)代謝的亞型UGT1A1和UGT1A9也占了36%。HCC患者癌旁肝組織微粒體(nHLMs-pooled)中CYPs和UGTs各亞型的比例與正常人沒有顯著的差異。但是,HCC腫瘤組織中代謝酶的蛋白表達比例出現(xiàn)了較大變化。UGT1A6在癌旁組織或正常肝組織中只占9～13%,而在腫瘤組織中,UGT1A6蛋白表達比例升高到38%。相反,腫瘤中UGT2B7表達比例從原來的22%降到了8%,同時UGT1A4也明顯降低(由38%降到22%)。CYP2A6蛋白表達比例在HCC腫瘤組織中明顯增高,而CYP3A4和CYP1A2明顯降低,其他亞型比例與正常組織相當。本研納入的25例肝組織樣本中CYPs和UGTs表達具有很強的個體差異性,這種特征與文獻報道一致。癌旁組織中CYP1A2和UGT2B7個體間表達差異高達52和39倍。CYP3A4,2D6,2C9和UGT1A1、1A9等與藥物代謝密切相關(guān)的亞型在個體間表達差異為4-17倍。本研究定量結(jié)果還發(fā)現(xiàn),HCC腫瘤中各種CYPs和UGTs亞型的蛋白表達也表現(xiàn)出了很強的個體差異性。而且由于腫瘤細胞對代謝酶調(diào)節(jié)機制存在個體差異,很多亞型在個體腫瘤組織間的表達差異性遠大于癌旁組織。CYPs和UGTs代謝酶對于各種外源性物質(zhì)包括抗癌藥物的活化或滅活具有重要作用。而這些代謝酶表現(xiàn)出的個體化差異會使得藥物在個體代謝出現(xiàn)很大差異,從而使給予不同個體相同劑量藥物時,產(chǎn)生截然不同的治療作用或毒性作用。這種因人而異的治療差異會嚴重影響臨床疾病如肝癌的藥物治療。因此,針對CYPs和UGTs表達差異的個體化治療方案對于肝癌的治療將會有重要意義。2.HCC腫瘤組織中CYPs酶代謝活性及其對抗腫瘤藥物處置能力變化研究本研究系統(tǒng)的闡明了HCC腫瘤組織及其癌旁組織中7種CYPs亞型對探針底物代謝能力的變化特征。酶代動力學研究結(jié)果表明,與癌旁組織相比,HCC腫瘤組織中各種CYPs亞型對探針底物的清除速率均顯著降低。其中,CYP3A4和CYP1A2降低了20倍以上,CYP2D6、2C8、2C9和2E1降低了8倍,而CYP2A6僅降低了2倍。個體研究結(jié)果也顯示CYPs酶的代謝活性在80%以上患者腫瘤組織中降低了3倍以上。但也有部分腫瘤中CYPs活性未發(fā)生顯著變化,甚至出現(xiàn)增高,提示HCC腫瘤對CYPs活性的調(diào)控機制具有個體化差異。這些結(jié)果與HCC腫瘤組織中CYPs蛋白表達變化趨勢高度一致。說明腫瘤組織中CYP酶代謝速率的改變可能是由于蛋白含量變化所引起。另外,引起代謝速率改變的另一個原因是代謝酶蛋白分子本身催化能力的改變。本實驗通過計算CYPs酶對探針底物的轉(zhuǎn)化速率(TON)評價各CYPs亞型的催化能力。結(jié)果顯示,腫瘤組織中,除了CYP2C9和CYP2D6催化能力輕微變化(小于2倍),其他CYPs亞型催化能力均與癌旁組織和正常組織無顯著性差異。酶動學研究也表明腫瘤組織、癌旁組織和正常人肝組織中各種探針底物代謝的Km值都沒有明顯差異,并且表現(xiàn)相同的動力學特征。這些結(jié)果提示HCC腫瘤組織中CYPs酶蛋白分子基本特征并沒有顯著改變,CYPs酶代謝速率的改變并不是由于催化能力降低引起。HCC腫瘤組織中CYPs代謝酶活性的降低會直接導致組織對藥物及內(nèi)源性物質(zhì)處置能力改變。本研究對臨床治療HCC常用藥物索拉菲尼和替加氟在腫瘤組織中的代謝速率進行了研究。結(jié)果顯示,索拉菲尼在腫瘤組織中的滅活速率大幅度降低。這將會導致索拉菲尼更容易在腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生蓄積,增加了藥物對腫瘤的殺傷作用,而在癌旁組織中藥物則可以被正常的代謝。這可能是索拉菲尼治療HCC時較少出現(xiàn)肝毒性的一個原因。另外,研究結(jié)果還顯示,替加氟在腫瘤組織中活化為5-氟尿嘧啶的速率也顯著降低。提示替加氟在正常組織中的活化速率會顯著高于腫瘤組織,從而對正常肝組織產(chǎn)生更大的毒副作用。但是,在某些HCC患者腫瘤組織中(5號和20號)5-氟尿嘧啶的生成速率遠遠大于癌旁組織。臨床上對這類患者使用替加氟治療時,可能會顯著提高藥物殺傷腫瘤的作用,同時也會降低對周圍肝組織的毒副作用。3.HCC腫瘤組織中CYPs酶mRNA表達變化研究本研究采用Real-Time PCR對HCC患者腫瘤組織及對應(yīng)癌旁組織中7種CYPs酶亞型mRNA表達水平進行了定量研究。結(jié)果顯示各種CYPs亞型在肝腫瘤組織及癌旁組織中均有表達。通過對比發(fā)現(xiàn),大多數(shù)腫瘤組織中CYPs各亞型mRNA表達水平較癌旁組織均出現(xiàn)顯著降低。與癌旁組織相比,腫瘤組織中CYP3A4 mRNA平均表達水平降低了23倍。CYP2C8、2C9和2E1也降低了6-7倍。但是,腫瘤組織中CYP2D6平均表達量只降低了2.5倍。該結(jié)果與HCC腫瘤組織中CYPs各亞型蛋白表達降低趨勢一致。說明HCC腫瘤細胞可能在轉(zhuǎn)錄水平對CYPs酶的表達進行了調(diào)控,降低了mRNA表達水平,從而使CYPs蛋白表達下調(diào)。但是,部分個體腫瘤組織mRNA和蛋白表達水平變化不一致。這可能是腫瘤細胞通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制改變了mRNA穩(wěn)定性,或通過翻譯后修飾改變了CYPs蛋白的穩(wěn)定性,從而使腫瘤細胞蛋白及mRNA降解速率出現(xiàn)差異。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),癌旁組織中7種CYPs亞型mRNA表達水平之間具有廣泛的相關(guān)性。其中,CYP2C8、2C9和2A6 mRNA表達具有強相關(guān)性(r2≥0.8),提示這三種亞型轉(zhuǎn)錄過程可能具有相同的調(diào)控通路。除了CYP2E1外,CYP3A4與其他亞型mRNA表達也具有中等強度的相關(guān)性,提示這些亞型轉(zhuǎn)錄過程可能具有共同的調(diào)控因素,同時也會受到特殊調(diào)控因子的影響。但是,在HCC腫瘤組織中,CYPs酶mRNA表達水平之間的相關(guān)性減弱甚至消失,這可能是由于腫瘤細胞中各種核受體表達水平改變,從而造成CYPs調(diào)節(jié)紊亂所致。4. CYPs酶蛋白的變化與代謝活性及其對藥物處置能力的相關(guān)性研究分別采用LC-MS/MS蛋白定量方法及探針底物法測定HCC患者肝組織微粒體中7種CYPs酶蛋白表達及其代謝活性,并進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,HCC腫瘤組織及癌旁組織中CYPs酶代謝活性與其蛋白表達水平具有高度相關(guān)性。其中CYP2A6和CYP2D6的活性和蛋白表達相關(guān)性最強,相關(guān)系數(shù)大于0.9。此結(jié)果進一步說明了HCC患者肝組織中CYPs酶代謝活性的改變主要是由蛋白表達變化造成。另外,HCC腫瘤組織和癌旁組織中CYPs活性與其蛋白表達水平線性回歸斜率相似,說明兩種組織中CYPs酶蛋白分子催化活力相當。以上結(jié)果提示,測定HCC患者肝組織中CYPs代謝酶的蛋白含量可有效地對其活性變化進行評價,從而預測藥物在HCC患者肝組織中的代謝速率。CYPs和UGTs酶廣泛參與了抗腫瘤藥物的代謝。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HCC患者肝組織中,替加氟和索拉菲尼代謝速率速率分別于與CYP2A6和CYP3A4的活性及蛋白表達水平顯著相關(guān)。提示代謝酶活性可直接影響腫瘤藥物的活化或滅活速率。那么,對代謝酶的活性變化進行準確評價可有效地對藥物治療效果及毒性進行預測。四、結(jié)論綜上所述,HCC腫瘤中CYPs酶代謝活性顯著降低,其主要原因為CYPs酶蛋白及mRNA表達水平下調(diào)所致,而酶蛋白分子催化能力并未顯著改變。HCC腫瘤組織中CYPs表達的變化可顯著改變索拉菲尼和替加氟等抗癌藥物的代謝速率,推測可能會對藥物療效和毒性產(chǎn)生重要影響。本研究建立了一種快捷穩(wěn)定的LC-MS/MS方法可同時測定HCC腫瘤和癌旁組織中各種CYPs和UGTs蛋白絕對含量。利用此方法可準確的對患者肝組織各種代謝酶活性進行評價,從而對腫瘤組織和癌旁組織中藥物活化或滅活速率進行預測。我們期望本研究可為HCC患者合理用藥,提高藥物治療作用而降低毒副作用提供新的方法和思路。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

濃度的標準蛋白溶液ｌＯｕｌ，分別加入８００?ｕｌ超純水和２００ｕｌ考馬斯亮藍，混勻。??取上述樣品２００?ｕｌ加到石英微孔板（９６孔）中，使用酶標儀進行測定（紫外吸??收波長設(shè)為巧５?ｎｍ）。每個樣品平行制備并測定３次。最終制備標準曲線如圖２－１??所示。??比６?１?，？??Ｉ??Ｓ?０．４?？??ｒ．?，＇，／??ｙ?＝?０．０４４Ｘ?＋?０．０１１?Ｒ２?＝?０．９９８??０?Ｊ?＊?１?？??０?５?１０?１５??ＢＳＡ?Ｃｏｎ．?（ｍｇ／ｍｌ｜??圖２－１牛血清蛋白標準曲線??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＢＳＡ??�。ⅲ玻常玻㈨椫兄苽涞娜烁谓M織微粒體蛋白適量，用２５０?ｍＭ庶糖溶液稀釋??１０倍。按＂標準曲線制備＂方法步驟處理樣品，并進行測定。將樣品吸光度值??代入標準曲線回歸方程，計算微粒體總蛋白含量。結(jié)果如表２－２所示。??１４??

圖３－１使用ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ對目標蛋白序列進行計算機模擬水解參數(shù)設(shè)定??Ｆｉｇ．?３－１?Ｐａｒａｍｅｔｅｒ?ｓｅｔｔｉｎｇｓ?ｆｏｒ?ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｕｓｉｎｇ?ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ?ｓｏｆｔｗａｒｅ

：ｕｌｌｌ??ａ?、?々?々?去??Ｔｉｍｅ?（ｈｒ）??圖３－４氨基酸在水解條件下的穩(wěn)定性??Ｆｉｇ．?３－４?Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ?ｏｆ?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ?ｄｕｒｉｎｇ?ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ?ｏｆ?ａｃｉｄ?ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ??３４??

本文編號：2835786