一、研究背景肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床上常見(jiàn)的高致死率惡性腫瘤,5年死亡率超過(guò)90%,僅次于肺癌和胃癌。我國(guó)是HCC高發(fā)地區(qū),每年發(fā)病人數(shù)占全世界發(fā)病率50%。乙肝病毒(HBV)感染是HCC最主要的誘發(fā)因素之一,而我國(guó)HBV感染率高達(dá)58%,全國(guó)病毒攜帶者總數(shù)超過(guò)1億。因此,HBV誘發(fā)的肝細(xì)胞癌已成為我國(guó)最重要的公共健康問(wèn)題之一。手術(shù)是治療HCC的首選方法。但是,由于診斷技術(shù)限制,80%的患者確診時(shí)通常已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。因此,對(duì)于絕大多數(shù)HCC患者,安全有效的藥物治療極其重要。細(xì)胞色素P450酶(CYPs)和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是肝臟最主要的藥物代謝酶,廣泛參與了各種抗腫瘤藥物的代謝,從而影響腫瘤及癌旁正常細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。同時(shí),這些代謝酶還參與了各種(前)致癌物質(zhì)的活化和滅活,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。多數(shù)抗腫瘤藥物在對(duì)腫瘤產(chǎn)生毒性作用的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織造成損傷。臨床上使用這些藥物對(duì)HCC患者進(jìn)行治療時(shí)很難預(yù)測(cè)藥物對(duì)腫瘤的殺傷效能及對(duì)周圍組織的毒副作用。其主要原因是代謝酶的個(gè)體差異及其在HCC疾病狀態(tài)下活性和表達(dá)的變化,造成了藥物在體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的改變。因此,系統(tǒng)地闡明HCC狀態(tài)下CYPs和UGTs酶的表達(dá)及活性變化,對(duì)抗腫瘤藥物的合理使用及對(duì)治療效果的預(yù)估意義重大。另外,由于CYPs和UGTs酶的表達(dá)存在很大的個(gè)體差異,臨床上很難對(duì)每個(gè)患者肝組織中代謝酶的變化做出準(zhǔn)確判斷。因此,建立靈敏便捷的定量檢測(cè)方法對(duì)個(gè)體中CYPs和UGTs酶的代謝能力進(jìn)行監(jiān)控,對(duì)于HCC個(gè)體化治療具有重要意義。二、研究方法本研究共采集26例中低分化HCC患者肝組織樣本,對(duì)腫瘤組織和癌旁組織中CYPs和UGTs代謝酶的表達(dá)差異進(jìn)行了系統(tǒng)研究。具體過(guò)程如下：采用差速離心法分別提取個(gè)體腫瘤組織及癌旁組織微粒體蛋白。建立LC-MS/MS蛋白定量方法,利用非同位素標(biāo)記探針多肽對(duì)各樣本中7種CYPs亞型及5種UGTs亞型進(jìn)行絕對(duì)定量,考察HCC腫瘤與癌旁組織中各種代謝酶的蛋白表達(dá)差異及其變化規(guī)律。建立肝微粒體體外代謝模型,采用探針底物法對(duì)HCC腫瘤組織及癌旁組織中7種CYPs酶代謝活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí),測(cè)定抗癌藥物索拉菲尼及替加氟在腫瘤及癌旁組織樣本中的酶代動(dòng)力學(xué)參數(shù),考察HCC腫瘤組織對(duì)治療藥物處置能力的變化。提取HCC患者肝組織總RNA,采用Real-Time PCR方法研究腫瘤及癌旁組織中各CYPs亞型mRNA表達(dá)差異,闡明HCC腫瘤中CYPs蛋白及活性變化的初步原因,為進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平研究其具體分子機(jī)制提供參考。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.HCC腫瘤組織中CYPs和UGTs蛋白表達(dá)變化研究本研究建立了一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定、靈敏的LC-MS/MS方法可同時(shí)對(duì)人肝微粒體中7個(gè)CYPs和5個(gè)UGTs亞型進(jìn)行絕對(duì)定量。利用這個(gè)方法,我們首次對(duì)HCC腫瘤組織及癌旁組織中CYPs和UGTs酶的蛋白絕對(duì)含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,與癌旁組織相比,80%以上患者腫瘤組織中CYPs蛋白表達(dá)水平顯著降低。其中CYP1A2平均蛋白表達(dá)降低了20倍(34.4±14.3 vs 1.8±1.6 pmol/mg microsomal protein),CYP3A4(34.8±16.5 vs 5.5±8.9)、2D6(13.9±9.0 vs 3.8 ±2.6)、2C8(56.0±26.9 vs 6.1±5.1)、2C9(85.0±35.4 vs 8.4±9.0)和2E1(30.0±13.0 vs 7.7±11.8)降低了4-10倍,而CYP2A6僅降低了2倍(12.3±8.5 vs 6.5±17.1)。對(duì)UGTs酶蛋白定量結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,腫瘤組織中UGT1A1 (23.1±8.4 vs 9.1±8.4 pmol/mg microsomal protein)、1A4 (56.5±36.0 vs 13.5± 16.2)、1A9 (24.4±19.1 vs 13.3±11.8)、2B7 (37.2±26.4 vs 5.6±8.2)蛋白表達(dá)顯著降低2-7倍。但是,UGT1A6表達(dá)并未下調(diào)(14.7±10.2 vs 23.1±21.8,p0.05),其蛋白表達(dá)僅在20%的腫瘤中降低,而在50%患者腫瘤組織中顯著升高。提示UGT1A6可能與HCC腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制有關(guān)。另外,UGT1A6還可能作為HCC治療的新靶點(diǎn),為代謝酶相關(guān)治療藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。在正常人肝微粒體中(rHLMs-pooled), CYP2E1蛋白表達(dá)水平最高(30%),其次為CYP2C9 (21%)和CYP2C8 (14%)。 CYP3A4和CYP2D6是CYPs家族中最重要的兩個(gè)亞型,參與了市場(chǎng)上50%藥物代謝。但是,其蛋白表達(dá)比例僅為14%和5%。正常人肝微粒體中UGTs家族各亞型蛋白表達(dá)量差異較小。其中CYP1A4表達(dá)最高(占29%)。而主要參與藥物等外源性物質(zhì)代謝的亞型UGT1A1和UGT1A9也占了36%。HCC患者癌旁肝組織微粒體(nHLMs-pooled)中CYPs和UGTs各亞型的比例與正常人沒(méi)有顯著的差異。但是,HCC腫瘤組織中代謝酶的蛋白表達(dá)比例出現(xiàn)了較大變化。UGT1A6在癌旁組織或正常肝組織中只占9～13%,而在腫瘤組織中,UGT1A6蛋白表達(dá)比例升高到38%。相反,腫瘤中UGT2B7表達(dá)比例從原來(lái)的22%降到了8%,同時(shí)UGT1A4也明顯降低(由38%降到22%)。CYP2A6蛋白表達(dá)比例在HCC腫瘤組織中明顯增高,而CYP3A4和CYP1A2明顯降低,其他亞型比例與正常組織相當(dāng)。本研納入的25例肝組織樣本中CYPs和UGTs表達(dá)具有很強(qiáng)的個(gè)體差異性,這種特征與文獻(xiàn)報(bào)道一致。癌旁組織中CYP1A2和UGT2B7個(gè)體間表達(dá)差異高達(dá)52和39倍。CYP3A4,2D6,2C9和UGT1A1、1A9等與藥物代謝密切相關(guān)的亞型在個(gè)體間表達(dá)差異為4-17倍。本研究定量結(jié)果還發(fā)現(xiàn),HCC腫瘤中各種CYPs和UGTs亞型的蛋白表達(dá)也表現(xiàn)出了很強(qiáng)的個(gè)體差異性。而且由于腫瘤細(xì)胞對(duì)代謝酶調(diào)節(jié)機(jī)制存在個(gè)體差異,很多亞型在個(gè)體腫瘤組織間的表達(dá)差異性遠(yuǎn)大于癌旁組織。CYPs和UGTs代謝酶對(duì)于各種外源性物質(zhì)包括抗癌藥物的活化或滅活具有重要作用。而這些代謝酶表現(xiàn)出的個(gè)體化差異會(huì)使得藥物在個(gè)體代謝出現(xiàn)很大差異,從而使給予不同個(gè)體相同劑量藥物時(shí),產(chǎn)生截然不同的治療作用或毒性作用。這種因人而異的治療差異會(huì)嚴(yán)重影響臨床疾病如肝癌的藥物治療。因此,針對(duì)CYPs和UGTs表達(dá)差異的個(gè)體化治療方案對(duì)于肝癌的治療將會(huì)有重要意義。2.HCC腫瘤組織中CYPs酶代謝活性及其對(duì)抗腫瘤藥物處置能力變化研究本研究系統(tǒng)的闡明了HCC腫瘤組織及其癌旁組織中7種CYPs亞型對(duì)探針底物代謝能力的變化特征。酶代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明,與癌旁組織相比,HCC腫瘤組織中各種CYPs亞型對(duì)探針底物的清除速率均顯著降低。其中,CYP3A4和CYP1A2降低了20倍以上,CYP2D6、2C8、2C9和2E1降低了8倍,而CYP2A6僅降低了2倍。個(gè)體研究結(jié)果也顯示CYPs酶的代謝活性在80%以上患者腫瘤組織中降低了3倍以上。但也有部分腫瘤中CYPs活性未發(fā)生顯著變化,甚至出現(xiàn)增高,提示HCC腫瘤對(duì)CYPs活性的調(diào)控機(jī)制具有個(gè)體化差異。這些結(jié)果與HCC腫瘤組織中CYPs蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)高度一致。說(shuō)明腫瘤組織中CYP酶代謝速率的改變可能是由于蛋白含量變化所引起。另外,引起代謝速率改變的另一個(gè)原因是代謝酶蛋白分子本身催化能力的改變。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算CYPs酶對(duì)探針底物的轉(zhuǎn)化速率(TON)評(píng)價(jià)各CYPs亞型的催化能力。結(jié)果顯示,腫瘤組織中,除了CYP2C9和CYP2D6催化能力輕微變化(小于2倍),其他CYPs亞型催化能力均與癌旁組織和正常組織無(wú)顯著性差異。酶動(dòng)學(xué)研究也表明腫瘤組織、癌旁組織和正常人肝組織中各種探針底物代謝的Km值都沒(méi)有明顯差異,并且表現(xiàn)相同的動(dòng)力學(xué)特征。這些結(jié)果提示HCC腫瘤組織中CYPs酶蛋白分子基本特征并沒(méi)有顯著改變,CYPs酶代謝速率的改變并不是由于催化能力降低引起。HCC腫瘤組織中CYPs代謝酶活性的降低會(huì)直接導(dǎo)致組織對(duì)藥物及內(nèi)源性物質(zhì)處置能力改變。本研究對(duì)臨床治療HCC常用藥物索拉菲尼和替加氟在腫瘤組織中的代謝速率進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,索拉菲尼在腫瘤組織中的滅活速率大幅度降低。這將會(huì)導(dǎo)致索拉菲尼更容易在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蓄積,增加了藥物對(duì)腫瘤的殺傷作用,而在癌旁組織中藥物則可以被正常的代謝。這可能是索拉菲尼治療HCC時(shí)較少出現(xiàn)肝毒性的一個(gè)原因。另外,研究結(jié)果還顯示,替加氟在腫瘤組織中活化為5-氟尿嘧啶的速率也顯著降低。提示替加氟在正常組織中的活化速率會(huì)顯著高于腫瘤組織,從而對(duì)正常肝組織產(chǎn)生更大的毒副作用。但是,在某些HCC患者腫瘤組織中(5號(hào)和20號(hào))5-氟尿嘧啶的生成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于癌旁組織。臨床上對(duì)這類患者使用替加氟治療時(shí),可能會(huì)顯著提高藥物殺傷腫瘤的作用,同時(shí)也會(huì)降低對(duì)周圍肝組織的毒副作用。3.HCC腫瘤組織中CYPs酶mRNA表達(dá)變化研究本研究采用Real-Time PCR對(duì)HCC患者腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中7種CYPs酶亞型mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了定量研究。結(jié)果顯示各種CYPs亞型在肝腫瘤組織及癌旁組織中均有表達(dá)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),大多數(shù)腫瘤組織中CYPs各亞型mRNA表達(dá)水平較癌旁組織均出現(xiàn)顯著降低。與癌旁組織相比,腫瘤組織中CYP3A4 mRNA平均表達(dá)水平降低了23倍。CYP2C8、2C9和2E1也降低了6-7倍。但是,腫瘤組織中CYP2D6平均表達(dá)量只降低了2.5倍。該結(jié)果與HCC腫瘤組織中CYPs各亞型蛋白表達(dá)降低趨勢(shì)一致。說(shuō)明HCC腫瘤細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)CYPs酶的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控,降低了mRNA表達(dá)水平,從而使CYPs蛋白表達(dá)下調(diào)。但是,部分個(gè)體腫瘤組織mRNA和蛋白表達(dá)水平變化不一致。這可能是腫瘤細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制改變了mRNA穩(wěn)定性,或通過(guò)翻譯后修飾改變了CYPs蛋白的穩(wěn)定性,從而使腫瘤細(xì)胞蛋白及mRNA降解速率出現(xiàn)差異。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),癌旁組織中7種CYPs亞型mRNA表達(dá)水平之間具有廣泛的相關(guān)性。其中,CYP2C8、2C9和2A6 mRNA表達(dá)具有強(qiáng)相關(guān)性(r2≥0.8),提示這三種亞型轉(zhuǎn)錄過(guò)程可能具有相同的調(diào)控通路。除了CYP2E1外,CYP3A4與其他亞型mRNA表達(dá)也具有中等強(qiáng)度的相關(guān)性,提示這些亞型轉(zhuǎn)錄過(guò)程可能具有共同的調(diào)控因素,同時(shí)也會(huì)受到特殊調(diào)控因子的影響。但是,在HCC腫瘤組織中,CYPs酶mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性減弱甚至消失,這可能是由于腫瘤細(xì)胞中各種核受體表達(dá)水平改變,從而造成CYPs調(diào)節(jié)紊亂所致。4. CYPs酶蛋白的變化與代謝活性及其對(duì)藥物處置能力的相關(guān)性研究分別采用LC-MS/MS蛋白定量方法及探針底物法測(cè)定HCC患者肝組織微粒體中7種CYPs酶蛋白表達(dá)及其代謝活性,并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,HCC腫瘤組織及癌旁組織中CYPs酶代謝活性與其蛋白表達(dá)水平具有高度相關(guān)性。其中CYP2A6和CYP2D6的活性和蛋白表達(dá)相關(guān)性最強(qiáng),相關(guān)系數(shù)大于0.9。此結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了HCC患者肝組織中CYPs酶代謝活性的改變主要是由蛋白表達(dá)變化造成。另外,HCC腫瘤組織和癌旁組織中CYPs活性與其蛋白表達(dá)水平線性回歸斜率相似,說(shuō)明兩種組織中CYPs酶蛋白分子催化活力相當(dāng)。以上結(jié)果提示,測(cè)定HCC患者肝組織中CYPs代謝酶的蛋白含量可有效地對(duì)其活性變化進(jìn)行評(píng)價(jià),從而預(yù)測(cè)藥物在HCC患者肝組織中的代謝速率。CYPs和UGTs酶廣泛參與了抗腫瘤藥物的代謝。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HCC患者肝組織中,替加氟和索拉菲尼代謝速率速率分別于與CYP2A6和CYP3A4的活性及蛋白表達(dá)水平顯著相關(guān)。提示代謝酶活性可直接影響腫瘤藥物的活化或滅活速率。那么,對(duì)代謝酶的活性變化進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)可有效地對(duì)藥物治療效果及毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)。四、結(jié)論綜上所述,HCC腫瘤中CYPs酶代謝活性顯著降低,其主要原因?yàn)镃YPs酶蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)所致,而酶蛋白分子催化能力并未顯著改變。HCC腫瘤組織中CYPs表達(dá)的變化可顯著改變索拉菲尼和替加氟等抗癌藥物的代謝速率,推測(cè)可能會(huì)對(duì)藥物療效和毒性產(chǎn)生重要影響。本研究建立了一種快捷穩(wěn)定的LC-MS/MS方法可同時(shí)測(cè)定HCC腫瘤和癌旁組織中各種CYPs和UGTs蛋白絕對(duì)含量。利用此方法可準(zhǔn)確的對(duì)患者肝組織各種代謝酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià),從而對(duì)腫瘤組織和癌旁組織中藥物活化或滅活速率進(jìn)行預(yù)測(cè)。我們期望本研究可為HCC患者合理用藥,提高藥物治療作用而降低毒副作用提供新的方法和思路。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液ｌＯｕｌ，分別加入８００?ｕｌ超純水和２００ｕｌ考馬斯亮藍(lán)，混勻。??取上述樣品２００?ｕｌ加到石英微孔板（９６孔）中，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定（紫外吸??收波長(zhǎng)設(shè)為巧５?ｎｍ）。每個(gè)樣品平行制備并測(cè)定３次。最終制備標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２－１??所示。??比６?１?，？??Ｉ??Ｓ?０．４?？??ｒ．?，＇，／??ｙ?＝?０．０４４Ｘ?＋?０．０１１?Ｒ２?＝?０．９９８??０?Ｊ?＊?１?？??０?５?１０?１５??ＢＳＡ?Ｃｏｎ．?（ｍｇ／ｍｌ｜??圖２－１牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＢＳＡ??�。ⅲ玻常玻㈨�(xiàng)中制備的人肝組織微粒體蛋白適量，用２５０?ｍＭ庶糖溶液稀釋??１０倍。按＂標(biāo)準(zhǔn)曲線制備＂方法步驟處理樣品，并進(jìn)行測(cè)定。將樣品吸光度值??代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算微粒體總蛋白含量。結(jié)果如表２－２所示。??１４??

圖３－１使用ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ對(duì)目標(biāo)蛋白序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬水解參數(shù)設(shè)定??Ｆｉｇ．?３－１?Ｐａｒａｍｅｔｅｒ?ｓｅｔｔｉｎｇｓ?ｆｏｒ?ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｕｓｉｎｇ?ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ?ｓｏｆｔｗａｒｅ

：ｕｌｌｌ??ａ?、?々?々?去??Ｔｉｍｅ?（ｈｒ）??圖３－４氨基酸在水解條件下的穩(wěn)定性??Ｆｉｇ．?３－４?Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ?ｏｆ?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ?ｄｕｒｉｎｇ?ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ?ｏｆ?ａｃｉｄ?ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ??３４??

本文編號(hào)：2835786