研究背景建立人妊娠的第一個關(guān)鍵步驟是人胚胎植入到子宮內(nèi)膜上皮細胞,這一過程稱為胚胎著床。人胚胎著床是一個復雜的、繁瑣的過程,在此期間,胚胎首先定位,再粘附到子宮內(nèi)膜層上,接著是胚胎穿透子宮內(nèi)膜上皮細胞層(EEC)層入侵到子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ESC)層。在這一過程中,胚胎從桑葚胚發(fā)育成囊胚,子宮內(nèi)膜上皮細胞分化成對胚胎具有可接受性的容受性子宮內(nèi)膜,同時,囊胚的發(fā)育與子宮內(nèi)膜的分化具有同步性,胚胎著床才能獲得成功。哺乳動物胚胎著床過程,子宮內(nèi)膜均對胚胎具有容受性,容受性期間,無粘附能力的子宮內(nèi)膜上皮細胞轉(zhuǎn)化成有粘附能力的子宮內(nèi)膜,可以使胚胎粘附到子宮內(nèi)膜上皮層,并穿透子宮內(nèi)膜上皮層到間質(zhì)層。容受性的子宮內(nèi)膜具有以下幾個特點：1)子宮內(nèi)膜上皮細胞屏障的破壞,子宮內(nèi)膜上皮細胞頂體膜的結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)變；2)子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌階段特異性的蛋白質(zhì)和糖蛋白；3)在子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌物的調(diào)節(jié)下,子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化改變；4)子宮內(nèi)膜細胞的細胞外基質(zhì)的降解和重塑。研究表明,子宮內(nèi)膜上皮細胞和間質(zhì)細胞的分化均受月經(jīng)周期類固醇激素水平的調(diào)節(jié),這確保了子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性在排卵后的第7-11天,這一時期稱為胚胎著床的“窗口期”�？梢娫谠缙诘呐咛ブ仓�,首先是子宮內(nèi)膜細胞屏障的破壞,之后發(fā)生重塑,但其重塑的機制尚不明確,細胞的遷移和分化是否跟重塑相關(guān)也不明確。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞獲得成纖維細胞特性,它參與了人體許多的生理病理過程,包括胚胎發(fā)生、器官分化,組織炎癥,創(chuàng)傷愈合等,EMT的特征是細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,包括腫瘤細胞的早期發(fā)生和轉(zhuǎn)移。同時有研究證實,在植入過程中子宮內(nèi)膜上皮細胞的EMT引起的細胞遷移對容受性的子宮內(nèi)膜上皮細胞的重塑起著十分重要的作用。E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白是鈣粘蛋白超家族的成員,在正常的上皮細胞中表達,是一種跨膜粘附分子,能介導同種細胞的粘附,并與維持細胞的極性相關(guān)。目前眾多的研究表明,在EMT中,發(fā)生了E-鈣粘蛋白的下調(diào)和N-鈣粘蛋白的上調(diào),這種現(xiàn)象被稱為“鈣粘蛋白開關(guān)”�！扳}粘蛋白開關(guān)”與肌動蛋白重排相關(guān),如應力纖維的形成和皮層肌動蛋白的減弱等細胞運動加速度的控制。許多轉(zhuǎn)錄因子抑制E-鈣粘蛋白的表達,如Snail/Slug家族蛋白、E12/E47和Twist以及ZEB家族。除了細胞粘附分子的參與,還有細胞骨架蛋白、細胞基質(zhì)金屬酶等均參與了EMT的發(fā)生和調(diào)控。波形蛋白(Vimentin)是一種細胞骨架蛋白,是間質(zhì)細胞的標記物,在上皮細胞中不表達。波形蛋白參與維持細胞與細胞器形態(tài)、促進細胞粘附及移行及細胞凋亡相關(guān)。波形蛋白表達異常增多導致細胞骨架蛋白發(fā)生變化,使得上皮源性細胞具有間質(zhì)細胞行為,更易于侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT過程中,波形蛋白的表達明顯上升,在腫瘤的轉(zhuǎn)移細胞中,波形蛋白過度表達,因此波形蛋白被認為是EMT的分子之一。但在胚胎植入過程中的作用尚不明確。ZEB家族屬于鋅指蛋白類的轉(zhuǎn)錄因子,包含ZEB1和ZEB2。ZEB1能與E-鈣粘蛋白編碼基因的啟動子上的E2盒的[CACCT(G)]結(jié)合,抑制E-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄,誘導細胞發(fā)生EMT,增強細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。目前研究證實ZEB1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起到十分重要的作用,并與microRNA-200相互抑制,成一條負反饋途徑,在腫瘤細胞中調(diào)控Notch信號途徑。ZEB1在人子宮肌層和子宮間質(zhì)的表達,在月經(jīng)周期中的分泌期(體內(nèi)雌孕激素水平高)顯著高于增生期(體內(nèi)雌孕激素水平較低)。在胎牛的母胚界面檢測到ZEB1的高表達,在小鼠的胚胎著床過程中存在著EMT過程,同時體外細胞實驗也初步證實了在胚胎著床過程,胚胎粘附到子宮內(nèi)膜細胞時發(fā)生了上皮間質(zhì)化過程,同時伴隨了粘附因子E-鈣粘蛋白的降低,以及上皮細胞標志物波形蛋白的上升和間質(zhì)細胞標記物角蛋白的降低,并且胚胎著床中的間質(zhì)化過程受到雌孕激素水平的調(diào)控。ZEB1和E-鈣粘蛋白的E-BOX元件結(jié)合,誘導腫瘤細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)化過程而引起腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。目前在生殖和胚胎發(fā)育過程的研究中,上皮間質(zhì)化過程逐漸受到重視,但國內(nèi)外的研究均較少,對其機制尚不明確。胚胎植入過程與腫瘤侵襲過程很大程度上具有相似性,而且兩者都存在上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化,而轉(zhuǎn)錄因子ZEB1在EMT中起著重要作用。研究表明ZEB1在人子宮肌層和子宮間質(zhì)均有表達,且在分泌期的表達顯著高于增生期,這一時期是胚胎植入的窗口期,因此我們推測ZEB1可能參與了胚胎植入過程的上皮間質(zhì)化過程,對胚胎植入過程起著重要的作用。在去勢后的δEF1/ZEB1 LacZ雜合子小鼠研究中發(fā)現(xiàn),ZEB1在ER受體定位的子宮肌層和間質(zhì)細胞表達且受雌孕激素的調(diào)節(jié)。根據(jù)以上胚胎植入過程的相關(guān)因子如E-鈣粘蛋白、雌孕激素和ZEB1的密切關(guān)系,我們推斷ZEB1參與了胚胎植入過程,其機制可能是通過下調(diào)E-鈣粘蛋白促進了著床期子宮內(nèi)膜細胞的EMT過程,并且該過程可能受雌孕激素的調(diào)控。目前大量的研究證實了ZEB1在腫瘤發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。而ZEB1在胚胎發(fā)育過程中作為中胚層和神經(jīng)嵴細胞遷移能力標志以及在EMT中的關(guān)鍵作用已被證實。腫瘤的侵襲性和胚胎植入過程有很大的相似性。以往的研究結(jié)果初步說明ZEB1在胚胎植入過程中可能起了重要的作用,但目前在胚胎著床中的功能研究和機制探討尚屬于空白。臨床上對復發(fā)性流產(chǎn)、反復胚胎移植失敗、不明原因不孕癥的誘因,有學說認為是胚胎著床過程失敗,導致妊娠失敗。因此,對胚胎著床失敗的原因及其發(fā)生的機制仍亟待研究。研究目的本研究利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建ZEB1的shRNA慢病毒載體,同時建立人體外胚胎植入體外模型和妊娠小鼠模型,旨在研究ZEB1在胚胎植入過程中的作用,并對其促進胚胎著床的EMT的機制進行初步研究,為輔助生殖及不孕不育的治療提供新的理論依據(jù)。研究材料和方法1.利用qRT-PCR技術(shù)、免疫組織化學、Western Blot技術(shù)研究鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZEB1在正常人月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律。2.采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建ZEB1的shRNA慢病毒載體,將其轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞得到穩(wěn)定的細胞株,QRT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染的效果。并用細胞劃痕實驗、EDU增殖實驗和DNA復制實驗對其功能進行研究。同時利用人子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞與人絨毛膜癌JAR細胞建立人體外胚胎著床模型,研究ZEB1在人胚胎植入中的功能,并探討在人胚胎植入過程中,ZEB1是否通過下調(diào)E-Cadherin和上調(diào)Vimentin,介導子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生EMT,促進胚胎植入。3.建立妊娠小鼠模型,檢測ZEB1、E-Cadherin和Vimentin在小鼠胚胎圍著床期的子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律,研究ZEB1在小鼠胚胎圍著床期子宮內(nèi)膜引起的EMT過程。4.同時將RNA干擾后的小鼠ZEB1-shRNA稀釋液注入著床前小鼠宮腔,觀察小鼠的妊娠結(jié)局,初步探討ZEB1在小鼠胚胎著床過程的作用。5.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計,計數(shù)資料用χ2檢驗,計量資料中,兩個樣本之間比較采用均值±標準差(X±S)表示,行t檢驗；多個樣本之間比較采用方差分析,滿足方差齊性的采用單因素的LSD檢驗,不滿足方差齊性的用Welch檢驗,用F值表示,P0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.利用qRT-PCR技術(shù)及Western blot檢測ZEB1mRNA和ZEB1蛋白的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZEB1在人子宮內(nèi)膜的增生早(mRNA:0.018±0.006; Protein: 1.000±0.100)、中(mRNA:0.175±0.006; Protein:0.987±0.076)、晚(mRNA:0.019±0.004; Protein:1.170±0.176)期、分泌早(mRNA: 0.022±0.007; Protein:1.357±0.832)、中(mRNA:0.043±0.015; Protein: 1.853±0.150)、晚期(mRNA:0.026±0.007; Protein:1.330±0.128)均有表達,以分泌中期的最為顯著,和增生期以及分泌早期、晚期(mRNA: F=12.99, P=0.000; Protein:F=19.988, P=0.000)的比較,差異具有統(tǒng)計學意義。2.成功構(gòu)建ZEB1-shRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染RL95-2細胞,得到穩(wěn)定的ZEB1-shRNA-RL95-2細胞株,并對其功能進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該細胞和陰性對照細胞的ZEB1 (0.326±0.053 vs 1.001±0.138, t=-12.525, P=0.000)和Vimentin (0.498±0.117 vs 1.000±0.230, t=-4.403, P=0.000)的表達顯著下調(diào),E-Cadherin (3.260±0.342 vs 1.001±0.138, t=13.869, P=0.000)的表達顯著上調(diào)。同時,72h開始,細胞的增殖能力(0.72±0.07 vs 0.94±0.09,F=4.329,P=0.003)、遷移力、DNA復制能力(43.26±5.11 vs 62.73±7.29,F=3.788,P=0.019)以及對JAR球體的粘附能力(0.398±0.065 vs 0.833±0.053,t=16.425,P=0.000)與陰性對照細胞相比也顯著下降,有統(tǒng)計學意義。3.運用qRT-PCR和Western blot分別對未孕小鼠和孕2.5-6.5天小鼠子宮內(nèi)膜ZEB1的mRNA和蛋白表達進行定量研究,結(jié)果顯示妊娠小鼠子宮內(nèi)膜ZEB1mRNA (mRNA:D2.5:0.028±0.007, D3.5:0.031±0.007, D4.5: 0.042±0.006, D5.5:0.031±0.008, D6.5:0.025±0.007)和蛋白(Protein: D2.5:0.032±0.005, D3.5:0.035±0.011, D4.5:0.041±0.002, D5.5: 0.029±0.012, D6.5:0.028±0.005)的表達高于非妊娠(mRNA:0.018±0.009,Protein:0.027±0.005)小鼠子宮內(nèi)膜,且ZEB1 mRNA和蛋白的表達隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,在小鼠著床窗第4.5天達到最高,與其他妊娠組之間行兩兩比較,差異具有統(tǒng)計學意義(mRNA:F=11.165, P=0.000;蛋白：F=14.66, P=0.000)。ZEB1 mRNA和蛋白的表達從第5.5天開始下降。免疫組化染色結(jié)果顯示：ZEB1蛋白在未孕和妊娠小鼠子宮內(nèi)膜組織都有表達。陽性著色部位主要在細胞核,特別是上皮細胞(包括腔上皮和腺上皮細胞)胞核,妊娠小鼠基質(zhì)細胞胞核也有較豐富的表達。ZEB1蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細胞的陽性表達隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢,第4.5天最為明顯,直到第5.5天開始降低；而基質(zhì)細胞的陽性表達在妊娠2.5天幾乎未見,而在第3.5天逐漸增加,6.5天開始降低(圖17)4.對小鼠子宮內(nèi)膜E-Cadherin的mRNA和蛋白表達進行研究,結(jié)果顯示非妊娠小鼠子宮內(nèi)膜E-Cadherin的mRNA (CtrlD0:1.87±0.66)和蛋白(CtrlD0:1.000±0.251)表達高于妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜E-Cadherin (mRNA:D2.5:1.10±0.389, D3.5:0.75±0.15, D4.5:0.30±0.13, D5.5: 0.39±0.11, D6.5:0.80±0.22) (Protein:D2.5:0.633±0.119, D3.5: 0.553±0.058, D4.5:0.213±0.029, D5.5:0.517±0.086, D6.5:0.520±0.026)的表達,且隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,在小鼠著床窗口期第4.5天的表達降到最低,與妊娠各組之間E-Cadherin的mRNA和蛋白的表達兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(mRNA:F=26.379, P=0.000:蛋白：F=32.188, P=0.001)。E-Cadherin的表達從第6.5天開始上升。E-Cadherin在內(nèi)膜上皮細胞的陽性著色部位主要在細胞漿,尤其妊娠上皮細胞(包括腔上皮和腺上皮細胞)胞漿,小鼠基質(zhì)細胞的胞漿幾乎未見染色,且隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢,在第4.5天最為明顯。5.對小鼠宮內(nèi)膜Vimentin的mRNA和蛋白表達進行研究,結(jié)果顯示非妊娠小鼠子宮內(nèi)膜Vimentin的mRNA (CtrlD0:0.59±0.21)和蛋白(CtrlD0: 0.99±0.40)表達低于妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜(mRNA:D2.5:1.19±0.15, D3.5:1.59±0.40, D4.5:2.92±0.99, D5.5:2.13±0.51, D6.5:1.82±0.59)(Protein:D2.5:1.23±0.24, D3.5:1.64±0.26, D4.5:2.37±0.20, D5.5: 1.67±0.11, D6.5:1.52±0.31) Vimentin的表達,且隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,在小鼠著床窗口期第4.5天達高峰,且與妊娠各組之間Vimentin的mRNA和蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學意義(mRNA:F=23.914,P=0.000；蛋白：F=9.191,P=0.001),Vimentin的表達第5.5天的表達開始顯著下降。6.在小鼠胚胎著床前的1天,經(jīng)小鼠的宮角注射ZEB1-shRNA稀釋液或ZEB1-shCtrl陰性對照,繼續(xù)飼養(yǎng)至妊娠第8天,脫頸椎法處死小鼠,觀察ZEB1-shRNA對小鼠胚胎著床的數(shù)量的影響。結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)ZEB1-shRNA組小鼠的胚胎著床的數(shù)量明顯少于生理鹽水側(cè)子宮,差異有統(tǒng)計學意義(1.875±0.835 vs 7.375±1.408, t=9.505, P=0.000); ZEB1-shCtrl組小鼠的胚胎著床的數(shù)量與生理鹽水側(cè)子宮無差別,差異無統(tǒng)計學意義(6.375±1.119 vs7.500±1.119,t=1.888,P=0.080)。結(jié)論1.ZEB1在月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜有表達,而且分泌中期的表達顯著增高,分泌中期是胚胎植入的窗口期,ZEB1在人胚胎著床窗口期的高表達,提示ZEB1可能參與了子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié),對人早期胚胎著床起了重要的作用。2.ZEB1基因的敲除明顯抑制子宮內(nèi)膜RL95-2細胞的增殖和遷移,對模型胚胎JAR球體的粘附率顯著下降,同時E-鈣粘蛋白表達增加,波形蛋白表達減少,提示ZEB1在人胚胎植入過程中,可能是通過下調(diào)E-Cadherin和上調(diào)Vimentin,促進了胚胎植入過程中的EMT過程,引起了子宮內(nèi)膜上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化,增加細胞的遷移能力。上皮細胞的遷移使上皮細胞屏障被破壞,改變了子宮內(nèi)膜容受性,促進胚胎的粘附和植入。3.EMT的標記因子ZEB1和Vimentin在著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜的高表達、E-Cadherin的低表達均提示了小鼠胚胎植入過程中也發(fā)生了EMT過程。ZEB1可能也是通過下調(diào)E-Cadherin,觸發(fā)鈣粘蛋白開關(guān),上調(diào)波形蛋白,抑制粘附分子的表達,誘發(fā)了EMT的發(fā)生,引起細胞骨架的改變和應力纖維的改變,促進子宮內(nèi)膜上皮容受性的改變,使著床部位的上皮屏障發(fā)生破壞和重塑,促進了胚胎植入的發(fā)生和子宮內(nèi)膜的蛻膜化改變。4.在著床前期的小鼠的宮角注入小鼠ZEB1-反義寡核苷酸的稀釋液,顯著降低了胚胎著床率,再一次證明了ZEB1在著床起著重要的調(diào)節(jié)作用,可能是促進了子宮內(nèi)膜上皮細胞的EMT過程,促進了子宮內(nèi)膜上皮細胞的分化和重塑。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R321
【部分圖文】：

通常使用溶解曲線的負一次微分曲線進行溶解曲線分析的較多。逡逑Ｗ邋ＧＡＰＤＨ作內(nèi)參，通過Ｒｅａｌ邋Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測差異蛋白ＺＥＢ１基因Ｒｅａｌ逡逑ＴｉｍｅＰＣ民擴增后的溶解曲線（圖１）。由圖可見目的基因的溶解曲線只出現(xiàn)一逡逑個峰，說明沒有引物二聚體等非特異性擴增的產(chǎn)生，擴增過程較為理想，引物逡逑設(shè)升較為合理，可進行后續(xù)的相對定量分析處理。逡逑２７逡逑

泌期ＺＥＢ１的表達較增殖期強，Ｗ分泌中期（０．０４３邋＋邋０．０１５）的最為顯著，和增逡逑生期Ｗ及分泌早期（０．０２２邋＋邋０．００７）、晚期（０．０２６邋＋化００７）的比較，差異有統(tǒng)逡逑計學意義（Ｆ＝１２．９９，Ｐ＝０．０００）（圖２，表１）。分泌中期是胚胎桂入的窗口逡逑期，沈Ｂ１在此時的子宮內(nèi)膜的表達增強，可能與子宮內(nèi)膜的容受性相關(guān)。逡逑３－逡逑0邋＊＊＊逡逑也0逡逑２－逡逑ＵＪ邋0逡逑含巧邐戶Ｉ邐？逡逑Ｋ邋２邋１－邐－Ｔ－逡逑ｉ邋Ｊ胃ＩＪＵＩ」＂？■，逡逑炒合、於＞／邋＜／於ｓ／逡逑Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邐Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ逡逑圖２邐ＺＥＢｌ邋ｍＲＮＡ在月經(jīng)周期的增生期和分泌期予宮內(nèi)膜表達的表達逡逑Ｆｉｇ．邋２邐Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｚ巨ＢＩ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｈｕｍａ打邋ｅｎｄｏｍｅｔｒ

３．２NＲＬＷ－２細胞和正子胞形ＲＬ９５－２細胞成上皮細胞形態(tài)，多邊形，無細胞極性，缺乏頂膜結(jié)構(gòu)。正常逡逑子宮內(nèi)膜上皮細胞的形態(tài)呈多邊形，排列緊密，有頂膜結(jié)構(gòu)，有細胞極性（圖逡逑４）。逡逑

本文編號：2825963