研究背景TNFRSF10B是一種TRAIL受體,屬于TNF受體超家族。細(xì)胞凋亡過(guò)程中TNFRSFIOB定位于細(xì)胞膜,與配體TRAIL結(jié)合并發(fā)生三聚體化,進(jìn)而招募FADD、 CASP8等形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC),啟動(dòng)CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明TNFRSFIOB在多種抗腫瘤試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是在某些生理或病理?xiàng)l件下,未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集誘導(dǎo)的一系列反應(yīng)。DDIT3是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子,由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三條通路EIF2AK3、ATF6、ERN1α共同調(diào)控。文獻(xiàn)報(bào)道在腫瘤細(xì)胞中多種化療藥物如lonafarnib、MG132、CDDO-Me等通過(guò)DDIT3上調(diào)TNFRSF10B表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATF4和ATF3均是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的重要蛋白,多種刺激誘導(dǎo)它們表達(dá)上調(diào)。研究報(bào)道ATF3抑制DDIT3基因轉(zhuǎn)錄,而DDIT3則抑制ATF3蛋白的功能；同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道ATF3促進(jìn)DDIT3表達(dá)。MAPK1在不同類型的細(xì)胞和不同刺激下發(fā)揮促凋亡或抗凋亡作用。研究表明MAPK1增強(qiáng)多種細(xì)胞中cisplatin和celecoxib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。RPS6KA3是MAPK1的下游底物,屬于Ser/Thr激酶家族,在細(xì)胞存活、增殖和凋亡中發(fā)揮雙重作用。近期研究表明MAPK1和RPS6KA3通過(guò)調(diào)節(jié)ATF4和DDIT3的表達(dá)而影響TNFRSFIOB的表達(dá)。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中起重要作用。一般認(rèn)為PKCδ是促凋亡蛋白,凋亡刺激下PKCδ在調(diào)節(jié)亞基和催化亞基之間被切割,產(chǎn)生具有持續(xù)生物學(xué)活性的片段,該片段促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PKCα一般在細(xì)胞存活中發(fā)揮作用,但有研究發(fā)現(xiàn)它也促進(jìn)細(xì)胞凋亡,如PKCα促進(jìn)喜樹堿誘導(dǎo)的凋亡。關(guān)于PKCα是否在PS-341誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用目前仍不清楚。很多前期數(shù)據(jù)表明蛋白酶體抑制劑PS-341單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物作用時(shí)具有明顯的抗腫瘤效果,但是PS-341誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制仍不是很清楚。我們的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明PS-341誘導(dǎo)TNFRSF10B上調(diào),所以本論文將進(jìn)一步探討在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PS-341誘導(dǎo)TNFRSF10B上調(diào)的分子機(jī)制。賴氨酸乙�；诙喾N生物過(guò)程中發(fā)揮作用,例如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、代謝和DNA復(fù)制等。蛋白乙�；腿ヒ阴；钠胶庥梢阴＾D(zhuǎn)移酶和去乙�；腹餐S持。越來(lái)越多的非組蛋白被證明發(fā)生乙�；揎�,例如TP53.PKM2、 c-MYC、NF-κB、 a-tubulin等；乙�；揎椨绊懙鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和功能。蛋白的乙�；皆诙喾N腫瘤中都有明顯變化,也是腫瘤形成一個(gè)重要因素,因此乙�；悄[瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。蛋白甲基化主要由甲基轉(zhuǎn)移酶催化,甲基化在蛋白相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)等過(guò)程發(fā)揮作用。肽基精氨酸去亞胺酶4(PADl4)是2004年發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶,負(fù)責(zé)組蛋白精氨酸殘基上單甲基化的去甲基化,并催化精氨酸變成瓜氨酸；同時(shí)調(diào)節(jié)非組蛋白的去甲基化,例如EP300、RPS2、ING4和nucleophosmin/B23等。CFLAR是CASP8/10特異的抑制蛋白,能被招募到DISC上,抑制PROCASP8/10切割活化。CFLAR在多種腫瘤如肝癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、卵巢癌中高表達(dá)；很多小分子藥物通過(guò)降低CFLAR蛋白水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,所以CFLAR是一個(gè)很有前景的腫瘤治療靶標(biāo)。研究表明CFLARL與XRCC6結(jié)合而穩(wěn)定CFLARL,乙�；腦RCC6干擾CFLARL/XRCC6復(fù)合物的形成,從而促使CFLARL泛素化降解。但是目前仍不確定CFLARL存在乙�；揎�。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)表明CFLARL含有一個(gè)甲基化位點(diǎn)。我們的目的是確定CFLARL是否存在乙�；图谆揎�,并研究翻譯后修飾的CFLARL在細(xì)胞中的作用和調(diào)控機(jī)制。研究方法1.利用siRNA干擾和基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究特定蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用；2.利用SRB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞存活率；3.利用western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平；4.利用免疫共沉淀和GST pull down實(shí)驗(yàn)研究蛋白間相互作用和特定蛋白的翻譯后修飾；5.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；6.利用熒光顯微鏡觀察蛋白在細(xì)胞中的定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.蛋白酶體抑制劑PS-341顯著誘導(dǎo)DDIT3表達(dá),并呈劑量和時(shí)間依賴性。2.在DDIT3 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B水平明顯降低,CASP8、CASP9、CASP3、PARP1的切割片段減少；流式細(xì)胞分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)在DDIT3 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,PS-341誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡降低。3.PS-341誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白如ATF、ATF3、HSPA5、p-EIF2S1和ERNlα表達(dá),并呈劑量和時(shí)間依賴性。4. Western blot實(shí)驗(yàn)表明,在對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,PS-341誘導(dǎo)TNFRSF10B上調(diào),CASP8、CASP9、CASP3活化和PARP1失活,但在ATF3 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中這些現(xiàn)象受到明顯抑制；SRB實(shí)驗(yàn)顯示抑制ATF3增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的存活：流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)PS-341誘導(dǎo)的對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡率為41%,ATF3 siRNA轉(zhuǎn)染的凋亡細(xì)胞只有26%。5.在H460、A549、H157細(xì)胞中,敲低ATF4表達(dá)抑制PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B上調(diào)和CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng),同時(shí)PS-341誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡百分比從29%降低到19%。6.在H460、A549、H157細(xì)胞中,抑制ATF4表達(dá)降低了PS-341誘導(dǎo)的ATF3和DDIT3上調(diào)；在H157和Calu-1細(xì)胞中,抑制ATF3表達(dá),PS-341誘導(dǎo)的DDIT3上調(diào)受到輕微抑制,但ATF4表達(dá)不變；另一方面,敲低DDIT3表達(dá),ATF3表達(dá)輕微降低,ATF4表達(dá)仍沒(méi)有變化。利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步研究ATF3和DDIT3之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)DDIT3與ATF3相互結(jié)合形成復(fù)合物。7.當(dāng)PS-341作用于細(xì)胞時(shí),MAPK1和RPS6KA3的磷酸化水平明顯升高,并呈劑量和時(shí)間依賴性。在多種細(xì)胞中,用MRK特異抑制劑U0126抑制MAPK1和RPS6KA3活化,發(fā)現(xiàn)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B上調(diào)受到顯著抑制。8. Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PS-341誘導(dǎo)PKCδ切割活化,產(chǎn)生41kD片段,并呈劑量和時(shí)間依賴性。9.用siRNA干擾技術(shù)抑制PKCδ表達(dá),發(fā)現(xiàn)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B上調(diào)受到明顯抑制,而且CASP8、CASP9、CASP3和PARP1的切割形式明顯降低；而過(guò)表達(dá)PKCδ之后,PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B和CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng)明顯增強(qiáng)；SRB實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在PS-341處理時(shí)細(xì)胞存活率更低；流式細(xì)胞分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)PKC8 siRNA轉(zhuǎn)染后PS-341誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從41%降為23%。10.抑制PKC8表達(dá)后,PS-341誘導(dǎo)的MAPK1和RPS6KA3的磷酸化受到抑制,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4、ATF3和DDIT3的誘導(dǎo)也受到明顯抑制。11.在H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-PKC8質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)PS-341誘導(dǎo)PKCδ發(fā)生核轉(zhuǎn)位。12.用siRNA干擾技術(shù)抑制PKCa表達(dá)后,PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10OB上調(diào)受到抑制,CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng)明顯降低,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4、ATF3和DDIT3上調(diào)也受到抑制。13.在H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-PKCa質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)PKCa主要分布于細(xì)胞質(zhì),PS-341不能引起PKCa發(fā)生核轉(zhuǎn)位。14.在H1792和A549中敲低PADI4、CFLARL表達(dá)明顯降低。15.在細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染PADI4 siRNA和pcDNA3.1-CFLARL-Flag或pEBG-CFLARL質(zhì)粒,免疫共沉淀或GST pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制PADI4表達(dá)增強(qiáng)了CFLARL與XRCC6結(jié)合。16.在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CFLARL后進(jìn)行GST pull down實(shí)驗(yàn),western blot發(fā)現(xiàn)CFLARL存在精氨酸甲基化修飾。17.將CFLARL的Arg122突變?yōu)锳la,然后在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEBG-CFLARL和pEBG-CFLARL-R122A質(zhì)粒并進(jìn)行GST pull down實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)CFLARL-R122A與XRCC6的結(jié)合比CFLARL與XRCC6結(jié)合低。18.在293FT或H1792細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CFLARL和CFLARL-R122A,用CHX處理,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中CFLARL-R122A的降解速率要低于CFLARL的降解速率。19.在H1792細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-CFLARL與pEGFP-CFLARL-R122A質(zhì)�；騪EBG-CFLARl與pEBG-CFLARL-R122A質(zhì)粒,并用SAHA處理,發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)CFLARL-R122A的細(xì)胞中,SAHA誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白CASP8、 CASP3的活化和PARP1的失活明顯降低。20.蛋白質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示CFLARL存在乙�；揎�。結(jié)論1.PS-341增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中DDIT3表達(dá),DDIT3增強(qiáng)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B上調(diào)和細(xì)胞凋亡。2.PS-341激活非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。3.ATF3增強(qiáng)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B上調(diào)和細(xì)胞凋亡。4.ATF4促進(jìn)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B表達(dá)和細(xì)胞凋亡。5.ATF4上調(diào)ATF3和DDIT3表達(dá),ATF3和DDIT3形成復(fù)合物共同調(diào)節(jié)TNFRSF10B的表達(dá)。6. MAPK1/RPS6KA3信號(hào)通路調(diào)控PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B表達(dá)。7.PS-341切割活化PKC△并誘導(dǎo)PKC△發(fā)生核轉(zhuǎn)位；PKC△通過(guò)MAPK1/RPS6KA3信號(hào)通路和隨后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B表達(dá)和細(xì)胞凋亡。8.PKCA通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B表達(dá)和細(xì)胞凋亡。9.抑制PADI4表達(dá)抑制了CFLARL 的表達(dá)并促進(jìn)了CFLARL與XRCC6結(jié)合。10. CFLARL存在精氨酸甲基化修飾。11.抑制CFLARL的精氨酸甲基化抑制了CFLARL與XRCC6結(jié)合,增加了CFLARL的穩(wěn)定性并降低了SAHA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。12. CFLARl存在乙�；揎��？偟貋�(lái)說(shuō),本研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PS-341誘導(dǎo)PKC5依賴的TNFRSF10B表達(dá),主要通過(guò)MAPK1/RPS6KA3信號(hào)通路和隨后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；PKCa也通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)PS-341誘導(dǎo)的TNFRSF10B表達(dá)和細(xì)胞凋亡。另外我們首次證實(shí)CFLARL存在乙�；途彼峒谆揎�；抑制CFLARL的精氨酸甲基化修飾抑制CFLARL與XRCC6結(jié)合,增加CFLARL的穩(wěn)定性并降低SAHA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R730.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2823598