發(fā)布時間：2020-08-20 08:32

【摘要】：原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性進行性肝內(nèi)膽汁淤積性肝病,最終可發(fā)展為肝纖維化和肝硬化。PBC在世界各地均有分布,各年齡段均可發(fā)病,尤其好發(fā)于中年女性。西方國家報道的發(fā)病率較高。近年來,由于對PBC認識程度和疾病診斷水平的提高,我國報道的PBC病例數(shù)也呈大幅度上升趨勢。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準的目前可用于PBC治療的唯一藥物。研究發(fā)現(xiàn)長期使用UDCA可有效改善患者的各項指標,延緩疾病進展,減少肝硬化發(fā)生,降低肝移植需求率,提高患者的生存率。但仍有約1/3的患者對UDCA不應(yīng)答,40歲的PBC患者不應(yīng)答率甚至超過50%。因此,早期發(fā)現(xiàn)那些UDCA不應(yīng)答或部分應(yīng)答的PBC患者具有重要的臨床意義。溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP-2)是我們率先發(fā)現(xiàn)的PBC相關(guān)分子,前期研究發(fā)現(xiàn)LAMP-2對PBC病理診斷具有重要意義,且其在PBC肝臟組織中的表達與疾病病理分期正相關(guān)。但LAMP-2分子的確切功能尚待深入研究,尤其是其在PBC等膽汁淤積性疾病中的作用目前還不清楚。本研究共分三部分:1)鑒于肝穿病理檢查的局限性和有創(chuàng)性,從血清學(xué)角度出發(fā),利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測PBC患者血清中的LAMP-2含量,進一步結(jié)合患者臨床相關(guān)指標的變化,分析血清LAMP-2在PBC臨床中的意義,尤其是其對PBC患者UDCA生化應(yīng)答的評估價值。2)為了深入了解LAMP-2分子在PBC等膽汁淤積性疾病中的作用,借助轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases,TALENs),構(gòu)建LAMP-2基因敲除大鼠模型,并對該模型鼠的膽汁淤積表型進行鑒定。3)以所建的LAMP-2基因敲除大鼠模型為工具,探討LAMP-2與肝細胞膽汁淤積的關(guān)系,以及LAMP-2參與肝細胞膽汁排泄的可能機制。第一部分應(yīng)用血清LAMP-2評價PBC患者UDCA應(yīng)答的臨床研究【目的】UDCA是美國FDA批準的目前可用于PBC治療的唯一藥物。研究發(fā)現(xiàn)長期使用UDCA可有效改善患者的各項指標,延緩疾病進展,減少肝硬化發(fā)生,降低肝移植需求率,提高患者的生存率,但仍有約1/3的患者對UDCA不應(yīng)答。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LAMP-2在PBC患者肝臟組織中的表達與患者疾病病理分期正相關(guān)。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上探討PBC患者血清LAMP-2水平與疾病進展之間的關(guān)系,尤其是血清LAMP-2在評估患者UDCA生化應(yīng)答方面的價值�！痉椒ā吭摶仡櫺匝芯考{入了自2007年至2013年就診于我院(第四軍醫(yī)大學(xué),西京消化病醫(yī)院)的新診斷PBC患者102例。所有患者均接受UDCA治療,治療劑量為13~15 mg/kg/day。采集患者治療前和治療后1、3、6和12個月時的全血標本,收集血清。同時收集相應(yīng)時間點的隨訪資料,其中包括肝穿病理檢查結(jié)果和臨床相關(guān)檢測指標,如總膽紅素、ALP、GGT、AST、ALT、ALB和Ig M等。研究同時納入了經(jīng)由我院診斷的乙肝患者126例、丙肝患者114例,肝內(nèi)膽汁淤積患者(包括自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、藥物性肝病、Gilbert's病和Dubin-Johnson綜合征)27例,以及未發(fā)現(xiàn)明顯異常的健康對照者84例。各對照組年齡和性別均與PBC患者保持組內(nèi)平衡。所有對照者均收集有治療前的血清標本,以及相應(yīng)時間點的隨訪資料。利用ELISA方法檢測PBC患者及對照者血清中的LAMP-2含量,進一步分析血清LAMP-2在PBC臨床中的意義�！窘Y(jié)果】1)治療前PBC患者血清LAMP-2水平明顯高于乙肝患者、丙肝患者、肝內(nèi)膽汁淤積患者以及健康對照者。2)治療前不同PBC亞群患者血清LAMP-2水平不同,其中以晚期患者(III-IV期)和膽紅素1mg/d L的患者血清LAMP-2升高最明顯。3)治療前PBC患者血清LAMP-2水平不能獨立反映UDCA療效。4)PBC患者接受UDCA治療后,血清LAMP-2降低趨勢與肝臟相關(guān)指標的變化趨勢一致,并在UDCA治療3個月時降低即很明顯。5)PBC患者接受UDCA治療后,應(yīng)答患者血清LAMP-2降低更明顯。6)UDCA治療3個月時,PBC患者血清LAMP-2下降有助于患者UDCA應(yīng)答的判讀�！窘Y(jié)論】PBC患者接受UDCA治療3個月時,血清LAMP-2的下降有助于評判患者對UDCA的應(yīng)答。第二和三部分LAMP-2參與肝細胞膽汁排泄的機制研究【目的】LAMP-2分子在多種生物學(xué)進程中發(fā)揮重要作用,但該分子的確切功能尚待深入探討。我們前期研究發(fā)現(xiàn),PBC患者肝臟組織中LAMP-2表達與患者疾病進展密切相關(guān),血清LAMP-2變化對評判PBC患者UDCA生化應(yīng)答具有重要價值。本部分的研究目的在于探討LAMP-2在膽汁淤積性疾病中的作用,以及LAMP-2參與肝細胞膽汁排泄的可能機制�！痉椒ā坷肨ALENs技術(shù)構(gòu)建LAMP-2基因敲除大鼠模型,并以建立的基因敲除大鼠模型為工具,通過體內(nèi)研究探討LAMP-2與肝細胞膽汁淤積的關(guān)系,以及LAMP-2參與肝細胞膽汁排泄的可能機制。體外構(gòu)建LAMP-2過表達及LAMP-2 RNAi干擾細胞模型,并以所建細胞模型為工具,對體內(nèi)研究結(jié)果進行驗證�！窘Y(jié)果】借助TALENs技術(shù),成功構(gòu)建了LAMP-2基因敲除大鼠模型。進一步研究發(fā)現(xiàn):1)LAMP-2基因敲除大鼠肝臟表現(xiàn)有膽汁淤積的現(xiàn)象。2)LAMP-2基因敲除大鼠對膽汁淤積的耐受性降低,更易發(fā)生膽汁排泄障礙。3)相對和絕對定量同位素標記(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)差異分析結(jié)果顯示,LAMP-2基因敲除大鼠肝細胞毛細膽管膜轉(zhuǎn)運體異常改變。4)LAMP-2基因敲除大鼠肝臟毛細膽管膜上與膽汁排泄直接相關(guān)的重要轉(zhuǎn)運體多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,Mrp2)表達異常。5)LAMP-2基因敲除大鼠的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),LAMP-2通過調(diào)控Mrp2在肝細胞毛細膽管膜上的定位,影響肝細胞膽汁排泄過程。6)體外細胞學(xué)實驗支持:LAMP-2參與調(diào)控MRP2在肝細胞毛細膽管膜上的定位,進而可能參與肝細胞毛細膽管膜的形成,從而影響肝細胞膽汁排泄過程。【結(jié)論】LAMP-2分子通過調(diào)控Mrp2/MRP2分子在肝細胞毛細膽管膜上的定位,參與影響肝細胞毛細膽管膜的形成,最終影響肝細胞的膽汁排泄能力。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.22
【圖文】：

受損膽管周圍可見由上皮樣組織細胞和多核巨噬細胞形成的腫的特點是組織細胞胞質(zhì)內(nèi)有大量泡沫細胞，因此又稱脂質(zhì)（黃色瘤病變常使匯管區(qū)擴大，淋巴細胞彌散侵入肝小葉，形同碎屑樣壞死。細胞破壞膽管基底膜形成的、含有增生膽管和肉芽腫的碎屑樣壞死稱樣壞死，有別于自身免疫性肝炎的淋巴細胞性碎屑樣壞死[22, 23]。dwing 等[24]根據(jù) PBC 患者膽管損傷、炎癥和纖維化的程度，將該病的變分為四期（圖 1）：Ⅰ期（門管期），以匯管區(qū)炎癥為特征伴或不伴花，炎癥局限于匯管區(qū)。Ⅱ期（門管周圍期），以匯管區(qū)周圍的損害逐漸肝實質(zhì)，稱為界面性肝炎。匯管區(qū)周圍損害局部不規(guī)則，以細胞壞死被炎癥細胞及巨噬細胞分隔為特征，形成膽汁性碎屑樣壞死。Ⅲ期（間架扭曲變形為特征，伴有較多的纖維性隔膜形成，多數(shù)病例膽管數(shù)量期（硬化期），表現(xiàn)為正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成。值得注意的不均一，四個階段的病理特征可同時出現(xiàn)于同一塊組織中[19, 25]。

體產(chǎn)生的AMA均可識別大腸桿菌PDC-E2和OGDC-E2肽段，提示病原體可能表達與自身抗原相似的抗原表位，刺激機體產(chǎn)生抗自身抗體，引發(fā)交叉免疫反應(yīng)，成為PBC發(fā)病的觸發(fā)因素（圖2）[63]。微生物通過分子模擬機制誘發(fā)PBC的理論可以歸納為：（1）微生物的CpG模體可以刺激PBC患者外周血中的CD27+記憶性B細胞產(chǎn)生IgM，并且該記憶性B細胞產(chǎn)生IgM的現(xiàn)象是通過Toll樣受體-9 （Toll-like receptor 9，TLR 9）信號通路實現(xiàn)的。（2）CpG可以刺激PBC患者的B細胞產(chǎn)生AMA，過表達TLR 9、CD86分子，增強鉀通道KCa3.1活性。（3）CpG誘導(dǎo)的AMA分泌和TLR 9、CD86上調(diào)，都可以被鉀通道KCa3.1的特異性抑制劑TRAM所抑制。這些證據(jù)也提示：PBC患者的B細胞免疫依賴于增強的固有免疫反應(yīng)，并且TRAM-34可以影響PBC患者體內(nèi)的B細胞自身免疫反應(yīng)[66]。另一類抗原模擬物主要來自細胞外異生物質(zhì)，這些外來化合物可以通過結(jié)合或修飾作用

值得重視的是，這些研究證據(jù)均支持：凋亡過程中細胞類型的特異性差異以及對凋亡細胞的吞噬作用，是PBC患者特異性組織損傷的原因。目前研究認為以下三種機制可能參與了PBC患者BECs的損傷（圖3）：①殺傷性T細胞識別BECs表面MHC分子遞呈的PDC衍生抗原，從而造成對BECs殺傷；或自身抗體與BECs表面的PDC/PDC相關(guān)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，通過抗體依賴的細胞毒作用，激活NK細胞或其他效應(yīng)細胞，觸發(fā)對BECs的破壞。②在膽汁酸鹽的刺激下，碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運體AE2 等表達下調(diào)，使得BECs失去了“碳酸氫鹽保護傘”的保護，進而誘導(dǎo)BECs凋亡。③氧化應(yīng)激等因素觸發(fā)TGF-β活化，促使BECs發(fā)生重塑；或其它因素誘發(fā)的BECs衰老或上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

本文編號：2797765