【摘要】：研究背景糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation endoproducts,AGEs)在糖尿病多種血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。病理濃度的AGEs通過激活氧化應激,誘導活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成,從而破壞內(nèi)皮細胞功能,進而在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。新型降糖藥胰高血糖素樣肽1(Glucagon like Peptide-1,GLP-1)可通過降低血糖,改善微環(huán)境而間接保護內(nèi)皮細胞,也可通過受體或非受體依賴性途徑直接改善內(nèi)皮功能,抑制動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的發(fā)生、發(fā)展。國外研究發(fā)現(xiàn)GLP-1通過降低內(nèi)皮細胞的纖溶酶原激活物抑制因子1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)、血管粘附分子(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1, Vascular cell adhesion molecule, VCAM-1)的水平,減少高凝狀態(tài)和炎癥反應對內(nèi)皮的損傷。此外,研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1呈劑量依賴性降低AGEs誘導下內(nèi)皮細胞的ROS水平；蛋白激酶A-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Protein kinase A-Endothelial nitric oxide synthase, PKA-eNOS)信號通道是GLP-1抑制AGEs誘導的細胞損傷、促進內(nèi)皮細胞增殖的重要作用機制之一；GLP-1還可通過環(huán)磷酸腺苷／蛋白激酶A (Cyclic Adenosine monophosphate/Protein kinase Asystem,cAMP/PKA)信號途徑減少煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酸(Triphosphopyridine nucleotide,NADPH)合成,從而降低腎血管內(nèi)皮細胞氧化損傷。研究目的建立AGEs誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)模型,探討GLP-1是否具有拮抗AGEs誘導的氧化應激從而保護血管內(nèi)皮細胞的作用,并探討GLP-1是否可通過NADPH-、PKA-eNOS信號途徑發(fā)揮抗氧化、抗凋亡及抗線粒體損傷的作用。研究方法1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的分離、培養(yǎng)及鑒定。標本均來源于廣東藥學院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠新生兒臍帶經(jīng)消毒、沖洗、0.1%的I型膠原酶消化、收集等步驟得到分離的細胞。分離后接種細胞于培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%二氧化碳(Carbon dioxide, CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合達80%以上時,進行消化傳代,取生長良好的第3代細胞用于鑒定。使用免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞的標志物第Ⅷ因子相關抗原(Von Willebrand factor, vWF).2.建立AGEs誘導的HUVECs氧化損傷模型,探討AGEs對內(nèi)皮細胞的損傷作用。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)與D-葡萄糖溶于PBS中,避光孵育12周制備AGES。熒光分光光度計鑒定AGEs。以同樣條件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制備的溶液作為本實驗的陰性對照組。實驗分為：空白對照組、AGEs (100、200、400、600、800 ug/mL)組,以上6組作用HUVECs24 h(該部分結果將確定AGEs作用濃度,之后本論文的AGEs及BSA濃度不再特別說明,均采用該濃度)；以上確定作用濃度的AGEs分別作用HUVECs 12、24、36、48 h,另設一空白對照組。每孔加入10μM二氯熒光黃雙乙酸鹽(Dichlorofluorescein diace-tate,DCFH-DA),經(jīng)流式細胞儀檢測熒光強度。確定BSA及AGEs作用濃度及時間后,實驗分為：空白組、BSA組、AGEs組。配置四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3 '-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1)工作液后與HUVECs共孵育,經(jīng)流式細胞儀進行熒光檢測細胞線粒體膜電位的變化。按磷脂酰絲氨酸結合蛋V/碘化丙啶(Annexin V/Propidium iodide, Annexin V/PI)凋亡試劑盒說明書要求處理細胞后,經(jīng)流式細胞儀分析細胞凋亡。3.煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酸氧化酶4 (Triphopyridine nucleotideoxidase 4, NOX4)在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。空白對照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組,通過蛋白印跡法(Western Blotting法)檢測NOX4蛋白表達。GLP-1預處理細胞30 min后再加入AGEs, GLP-1濃度采用100 nM。(本課題前期研究顯示,該濃度下GLP-1可顯著抑制AGEs誘導的細胞凋亡。)(以下部分均按該順序操作,不再贅述。)空白對照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組,通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription PC, RT-PCR)檢測HUVECs的NOX4信使核糖核酸(Messenger RNA, mRNA)表達�？瞻讓φ战M、AGEs組、AGEs+陰性對照siRNA組、AGEs+NOX4siRNA組,檢測NOX4表達抑制前后,HUVECs的細胞凋亡率、ROS及線粒體膜電位水平。采用lipo-2000進行NOX4干擾性小核糖核酸(Small interfering RNA, siRNA)轉染,陰性干擾組采用亂序的siRNA為錯配對照組,應用RT-PCR鑒定轉染結果。4.蛋白激酶A-(Protein kinase A, PKA-)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶-(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS-)在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用空白對照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組分別檢測PKA蛋白表達�？瞻讓φ战M、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+PKA抑制劑組,檢測細胞eNOS蛋白表達、ROS生成水平及細胞凋亡率空白對照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+eNOS抑制劑組,檢測細胞一氧化氮(Ntrogen monoxide, NO)生成水平及細胞凋亡率。抑制劑預處理細胞1h后,加入(或不加)GLP-1 100 nM干預30 min,最后加AGES。統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,統(tǒng)計方法采用單向方差分析(One-Way ANOVA),其中兩兩比較采用LSD法,相關分析采用Spearman相關分析法,P0.050為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.充分掌握好消化時間,可得到純度較高的HUVECs。2.當AGEs作用濃度達400 ug/mL時,細胞ROS含量熒光值達到最大,當AGEs作用24 h后,細胞ROS含量熒光值達到最大。3.GLP-1抑制AGEs誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷。與空白組相比,BSA不影響內(nèi)皮細胞ROS生成(P=0.996),AGEs處理組較空白組ROS生成明顯增多(P=0.007),而GLP-1與AGEs共孵育組較AGEs單獨處理組的ROS熒光強度明顯減弱(P=0.010)。對AGEs誘導的內(nèi)皮細胞凋亡及細胞線粒體膜電位下降,加入GLP-1后可顯著降低細胞凋亡率(P=0.000),升高線粒體膜電位(P=0.014)。4.NOX4在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。AGEs促進內(nèi)皮細胞NOX4基因表達及其蛋白的合成,與空白對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P值分別為0.000和0.001)；在AGEs組加入GLP-1后,可顯著抑制內(nèi)皮細胞NOX4基因的表達及蛋白合成,與AGEs組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P值分別為0.000和0.003)。在AGEs誘導下,抑制NOX4mRNA表達后,內(nèi)皮細胞ROS含量熒光值顯著降低,與單純AGEs處理組及AGEs+陰性干擾組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.011和0.010)。干擾NOX4mRNA基因表達可顯著拮抗AGEs誘導的細胞凋亡及線粒體膜電位下降(P值分別為0.000和0.017),而予以非NOX4siRNA的小干擾處理則不影響細胞凋亡率及線粒體膜電位(P值分別為0.169和0.741)。5.PKA-在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。與空白對照組相比,BSA并不影響內(nèi)皮細胞PKA蛋白表達(P=0.186),而AGEs可誘導內(nèi)皮細胞的PKA蛋白表達顯著下調(diào)(P=0.003)；與AGEs單獨處理組相比,加入GLP-1共孵育后,AGEs誘導的PKA蛋白較AGEs組顯著上調(diào)(P=0.003)。AGEs組加入GLP-1后,其ROS含量熒光值較單純AGEs組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013)；AGEs+GLP-1組加入PKA抑制劑H-89·2HCl后,細胞ROS含量較加入H-89·2HCl前升高(P=0.045),即抑制PKA蛋白表達后可部分拮抗GLP-1對AGEs誘導內(nèi)皮細胞ROS生成的抑制作用。GLP-1與AGEs共孵育組的細胞凋亡率顯著低于AGEs組(P=0.001); PKA抑制劑H-89·2HCl可顯著拮抗GLP-1對AGEs誘導細胞凋亡的抑制作用(P=0.010)。GLP-1與AGEs共孵育組的細胞線粒體膜電位顯著高于AGEs組(P=0.011)；加入PKA抑制劑H-89·2HCl后,與AGEs+GLP-1組相比,細胞線粒體膜電位顯著降低(P=0.021)6. eNOS-在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。與空白組相比,AGEs可誘導內(nèi)皮細胞eNOS蛋白表達顯著下調(diào)(P=0.004)；在AGEs中加入GLP-1后,可使受抑制的eNOS蛋白表達再次上調(diào)(P=0.035)；AGEs組予以H-89-2HCl干預后,AGEs對eNOS蛋白表達的抑制作用無明顯改變(P=0.908)；而AGEs+GLP-1組予以H-89·2HCl干預后,細胞eNOS蛋白表達受抑制(P=0.045)。eNOS抑制劑L-NAME干預前,AGEs+GLP-1組較AGEs組NO水平顯著升高(P=0.017),細胞凋亡率顯著降低(P=0.000)。L-NAME干預后,AGEs+GLP-1組NO生成明顯受抑制(P=0.017),且細胞凋亡率增加(P=0.011)。結論1.成功建立一種能大量分離HUVECs的體外培養(yǎng)方法。2.GLP-1可通過抑制NOX4或激活PKA信號通道,拮抗AGEs誘導的HUVECs氧化應激及線粒體損傷,從而發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用。3.在AGEs誘導的HUVECs損傷中,GLP-1可通過PKA-eNOS-NO信號通道發(fā)揮保護作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2
【圖文】：

檢測結果表明，原代及傳代培養(yǎng)的細胞，整個細胞輪廓清楚，胞漿中可見逡逑黃緣色的巧光著色，胞核呈黑綠色，證實細胞內(nèi)有內(nèi)皮細胞特有的ｖＷＦ相關抗逡逑原存在（如圖１－２），用ＰＢＳ代替一抗的對照組為陰性反應。。逡逑S/逡逑圖１－２．觀察Y>光顯微鏡下原代人胳靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｕｎｂｉｌｉｃａｌ邋ｖｅｉｎ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ逡逑幻邋ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（邋Ｘ邋２００邋）逡逑１．３邋ｉ寸論逡逑ＨＵＶＥＣｓ與動物細胞相比，具備人體生理特性；與動化內(nèi)皮細胞相比Ｗ，取逡逑材更加經(jīng)濟方便、操作簡單，且具有與動脈內(nèi)皮細胞生物學特征相似的優(yōu)點Ｗ。逡逑目前市場上所銷售的ＨＵＶＥＣｓ細胞株都存在一些問題，而且，隨著傳代次數(shù)的逡逑增加，細胞問的相互作用及受外界環(huán)境的影響也增加，細胞的生物學巧性會發(fā)逡逑生一定的改變Ｗ，因此原代細胞顯得更加適合。原代ＨＵＶＥＣｓ在疾病和血管功逡逑能研究中，得到了越來越多的晚用體外培養(yǎng)的優(yōu)良原代細胞至少可傳代６逡逑次Ｗ上，用此原代細胞進行實驗，結果更加可靠。本實驗方法可分離得到大量逡逑內(nèi)皮細胞

－圖３－１－２．邋ＧＬＰ－１對ＡＧＥｓ誘導細胞Ｎ０Ｘ４表達的影響。＊；與空Ａ組比較，b6＜０．０５；邋＃；與逡逑ＡＧＥｓ中獨處理織比較，尸＜０．０５。逡逑Ｉ＾ｉｇｕｒｅ邋３－１－２．Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＧＬＰ－１邋ｏｎ邋化ｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｎ０Ｘ４邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＡＧＥｓ．＊邋ＶＳ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐb6＜０．０５；冉邋ｖｓ．邋ＡＧＥｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｒｏｕｐb6＜０．０５．逡逑３N２．２．２邋ＧＬＰ－ｌ對ＡＧＥｓ誘導ＨＵＶＥＣｓ邋ＮＯＸ４基因表達的影響逡逑

第三■章ＧＬＰ－１對ＡＧＥＳ誘導內(nèi)皮細胞損傷的影響及機制表３－１－５．Ｍ９NB／ｍＲＮＡ相對表達景（均數(shù)±標準差）逡逑Ｔａｂｌｅ３－１－５．Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｎ０Ｘ４ｔｘ＼ＲＮＡ（ｘ邋±邋ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ邐打邐Ｍ）斯ｍＲＮＡ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋Ｆ邐b6逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐３邐０．０００６７±０．0００２０逡逑ＡＧＥＳ邐３邐０．００３８２±０．０００２５＊邐２４４．７４８邐０．００ＧＬＰ－１邐３邐０．０００３９±０．００００２逡逑ＡＧＥｓ＋ＧＬＰ－１邐３邐０．０００８４±０．０００１３＃逡逑注：＊與空ｎ紐比較，b6＜０．０５；邋＃與ＡＧＥｓ＂單獨處理紐比較，尸＜０．０５。逡逑

本文編號：2752745