本文關(guān)鍵詞：雙孔鉀通道TREK-2門控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：鉀通道為目前發(fā)現(xiàn)亞型最多、結(jié)構(gòu)與功能最為復(fù)雜的一類離子通道,因其選擇性通透鉀離子特性而得名。鉀通道廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),同時外周如骨骼肌、心臟、血管、氣管及腺體細(xì)胞等也有表達(dá)。生理功能上,鉀通道主要參與維持細(xì)胞膜電位,調(diào)節(jié)可興奮細(xì)胞的興奮性,以及平滑肌的舒縮等過程。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同,鉀通道被分為四大類：電壓門控鉀通道(Kv)、鈣激活的鉀通道(Kca2+)、內(nèi)向整流鉀通道(Kir)和雙孔鉀通道(K2P)。在結(jié)構(gòu)上,K2P家族區(qū)別于傳統(tǒng)鉀通道最重要的特征是其同源二聚體的組裝形式,這與該家族成員每個亞基擁有獨特的四個跨膜片段(M1-M4)和兩個孔區(qū)(P1,P2)結(jié)構(gòu)域相關(guān),而傳統(tǒng)鉀通道為同源四聚體。TREK-2 (TWIK Related K+ channel 2,又稱K2P 10.1)為K2P家族成員之一,高表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在外周神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織也有分布。生理功能上,TREK-2主要參與維持靜息膜電位、調(diào)節(jié)興奮性、感覺傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、代謝調(diào)節(jié)和凋亡。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性,TREK-2參與眾多生理、病理和藥理作用進(jìn)程。作為細(xì)胞興奮性的關(guān)鍵調(diào)控因子,TREK-2的功能受到大量生理和化學(xué)信號的調(diào)控,如神經(jīng)遞質(zhì)、G蛋白耦聯(lián)受體、機械張力、胞內(nèi)外pH、溫度、多不飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸鹽、揮發(fā)性全身麻醉劑以及神經(jīng)保護劑等。在傳統(tǒng)鉀通道的離子電導(dǎo)通路上,從內(nèi)到外依次排列著內(nèi)門和外門,(又稱C-型門,或失活門)。離子通道調(diào)控的門控機制是指離子電導(dǎo)通路通過移動特定的門控元件,或變化空間構(gòu)象發(fā)生來實現(xiàn)對離子流入或流出的調(diào)控。目前認(rèn)為,鉀通道的門控機制可分為三種：第一,外門門控機制。目前的研究表明,細(xì)胞外液鉀離子濃度從生理水平更換為無鉀離子時,通道外門的構(gòu)象從通導(dǎo)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉峭▽?dǎo)狀態(tài)；另外,質(zhì)子化位于外門的pH感受器促進(jìn)外門坍塌。這些機制類似于電壓門控鉀通道的C-型失活(C-type inactivation)。由于上述兩種機制均導(dǎo)致外門構(gòu)象發(fā)生變化,因此將它們歸為一類,統(tǒng)稱外門門控機制。第二,內(nèi)門門控機制。內(nèi)門由跨膜螺旋束(helices bundle)形成,其調(diào)控關(guān)鍵元件為位于這些螺旋束中的甘氨酸鉸鏈(glycine hinge),介導(dǎo)螺旋束運動從而控制K+的流動。第三,N-型失活機制(N-type inactivation),為大多數(shù)Kv通道所使用。通道可以被通道本身的部分N末端(Nt)或者輔助的β亞基所阻斷,從而使通道快速關(guān)閉。研究表明,內(nèi)門和外門的活動并不是完全獨立的：外門通過其構(gòu)象變化發(fā)揮作用,而內(nèi)門運動可誘導(dǎo)離子選擇器構(gòu)象發(fā)生變化,即內(nèi)門運動與外門活動相耦聯(lián)。通過對電壓門控鉀通道Shaker和果蠅雙孔鉀通道KCNKO嵌合體進(jìn)行研究,證實此嵌合體也存在內(nèi)門和外門,它們呈正協(xié)同耦聯(lián),完全相反于一些電壓門控鉀通道的負(fù)協(xié)同耦聯(lián)。但是,由于此嵌合體的孔區(qū)仍然為同源四聚體,并不能真實反映K2P通道的雙二聚體(dimer of dimers)孔區(qū)結(jié)構(gòu)。因此,迄今為止,關(guān)于K2P通道中內(nèi)門和外門是否存在耦聯(lián)關(guān)系仍屬未知。另外,眾多研究表明鉀通道的活性除了受到大量生理和物理化學(xué)信號的調(diào)控,也受通道本身轉(zhuǎn)錄水平和選擇性翻譯起始(alternative translation initiation,ATI)機制的影響。選擇性翻譯起始(ATI)機制為蛋白翻譯水平調(diào)控機制之一,無論在真核生物或原核生物中,此機制均為增加蛋白分子多樣性的重要機制。越來越多的研究表明,由ATI機制產(chǎn)生的不同蛋白亞型可表現(xiàn)為功能的多樣性,比如在亞細(xì)胞定位方面,生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激素受體、蛋白激酶和一些離子通道的功能方面等。在TREK-2的N末端(Nt)存在三個翻譯起始位點,根據(jù)Kozak規(guī)則,第二個為最佳位點,而并非第一個。因此,核糖體掃描時可能漏掉第一個翻譯起始位點甚至前兩個,這將導(dǎo)致同一種TREK-2的mRNA可產(chǎn)生長、中、短三種不同長度Nt亞型。研究表明,這三種亞型對K+和Na+的選擇性相似,而電導(dǎo)存在顯著差異。那么,這種電導(dǎo)差異是否與離子選擇器構(gòu)象相關(guān)呢?Nt是否也影響其離子選擇器的構(gòu)象?這些仍需進(jìn)一步探討。綜上所述,雖然對于鉀通道的門控機制研究取得了不少進(jìn)展,然而對于雙孔鉀通道,特別是TREK-2的門控機制研究甚少,仍然存在一些基本科學(xué)問題等待回答。比如,TREK-2的第二和第四跨膜片段同樣存在甘氨酸鉸鏈,但此甘氨酸鉸鏈?zhǔn)欠裨趦?nèi)門活動中發(fā)揮功能?TREK-2通道中內(nèi)門和外門是否存在耦聯(lián)關(guān)系?TREK-2的C末端(Ct)是否影響門控機制及其可能的方式如何?TREK-2的Nt是否影響其離子選擇器的構(gòu)象?基于以上現(xiàn)狀,本研究應(yīng)用TREK-2激動劑2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-Aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)、胞外酸(pH。)和Ba2+作為工具,結(jié)合分子生物學(xué)和雙電極電壓鉗技術(shù),探討以上幾點未知問題,以期豐富TREK-2的門控機制理論。研究方法：(1)質(zhì)粒構(gòu)建,通道表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中和雙電極電壓鉗記錄電流構(gòu)建可以在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中高表達(dá)的pGH-19-TREK-2和pGH-19-TREK-1重組質(zhì)粒。根據(jù)研究目的的不同,應(yīng)用PCR技術(shù)構(gòu)建一系列結(jié)構(gòu)不同的突變體、缺失體、嵌合體和串聯(lián)二聚體,其中串聯(lián)體的兩個亞基應(yīng)用一個可靈活變動的多肽連接,多肽氨基酸序列為AAAGSGGSGGSTGGSSGSSGS,以上各種突變體、缺失體、嵌合體和串聯(lián)體質(zhì)粒均經(jīng)過DNA測序,結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對以保證DNA序列正確。以上各種質(zhì)粒應(yīng)用Xho I限制性內(nèi)切酶酶切線性化,然后體外轉(zhuǎn)錄成cRNA, cRNA顯微注射至非洲爪蟾卵母細(xì)胞,培養(yǎng)1-3天后,應(yīng)用雙電極電壓鉗技術(shù),將細(xì)胞膜電位鉗制在-80 mV,應(yīng)用Ramp模式從-120mV去極化至+60 mV,時間150 ms,記錄電流,觀察它們在生理鉀離子濃度(5mM)或者其他鉀離子濃度(0 mM、20 mM或40 mM)條件下,對胞外給予不同濃度的2-APB或Ba2+的反應(yīng),以及它們對不同pH細(xì)胞外液的反應(yīng)。研究結(jié)果:一、TREK-2內(nèi)門對外門的調(diào)控作用(一)2-APB激活TREK-2通道的機制研究1)2-APB通過作用于TREK-2的C末端發(fā)揮其激活功能。根據(jù)文獻(xiàn)報道,2-APB激活TREK-1和TREK-2通道的程度有著非常顯著的差異,我們推測兩種通道分子蛋白序列的低同源區(qū)可能導(dǎo)致了這種差異,同時與2-APB激活TREK-2密切相關(guān)。根據(jù)序列比對結(jié)果,位于胞內(nèi)區(qū)的N末端(N-terminus, Nt)和C末端(C-terminus, Ct)為兩條序列之間的低同源區(qū)。我們的實驗發(fā)現(xiàn),TREK-2的Nt缺失體對2-APB的敏感性與野生型相似,從而排除了Nt在該激活過程中的作用。交換兩種通道的Ct可完全交換2-APB敏感性：即連接TREK-1的Ct到TREK-2相應(yīng)位置可顯著降低TREK-2對2-APB的敏感性,連接TREK-2的Ct至TREK-1相應(yīng)位置則顯著提高TREK-1對2-APB的敏感性,表明2-APB通過作用于TREK-2的Ct發(fā)揮其激活功能。2)C末端近側(cè)區(qū)為2-APB與TREK-2相互作用所必需,而遠(yuǎn)側(cè)區(qū)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。根據(jù)序列比對結(jié)果,TREK-1和TREK-2的Ct近側(cè)區(qū)(proximal Ct, pCt)相對保守,而遠(yuǎn)側(cè)區(qū)(distal Ct, dCt)同源性較低。然而,缺失遠(yuǎn)側(cè)區(qū)導(dǎo)致TREK-2對2-APB的敏感性顯著上調(diào),表明pCt為2-APB發(fā)揮功能所必需,而dCt則起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。3)位于C末端近側(cè)區(qū)的368位組氨酸為2-APB的結(jié)合所必需。為進(jìn)一步尋找2-APB作用的關(guān)鍵氨基酸,我們將TREK-2 pCt區(qū)內(nèi)相對于TREK-1的非保守氨基酸(共7個)突變成TREK-1相應(yīng)的氨基酸,并檢測它們對2-APB的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有H368Y表現(xiàn)為敏感性下調(diào),表明第368位組氨酸在2-APB開放TREK-2的過程中發(fā)揮了必不可少的作用。為鑒定該氨基酸涉及2-APB的結(jié)合還是通道的門控過程(即門控的公共元件),我們檢測了H368Y對胞外pH值(pHo)變化的反應(yīng)。結(jié)果表明,該突變體的行為與野生型相似。已知pHo變化通過引發(fā)外門構(gòu)象變化調(diào)控通道活性,因此該氨基酸并不影響外門的功能,表明該氨基酸可能直接參與2-APB對TREK-2的結(jié)合。4)2-APB通過促進(jìn)TREK-2內(nèi)門開放發(fā)揮其激活通道功能。通過改變胞外鉀離子濃度誘導(dǎo)TREK-2通道外門構(gòu)象發(fā)生變化,并不影響2-APB的激活功能。另一方面,TREK-2的S4位點(第四個鉀離子結(jié)合位點,位于外門的最內(nèi)側(cè))突變體T172S和T281S對2-APB的敏感性也與野生型的相似。這些結(jié)果說明改變TREK-2的外門構(gòu)象并不影響2-APB對TREK-2通道的開放,提示2-APB的作用與外門構(gòu)象無關(guān)。第四跨膜區(qū)(M4)的甘氨酸鉸鏈突變體(G312A)對2-APB的敏感性顯著下調(diào),而M4為內(nèi)門的組成分,表明2-APB通過作用于內(nèi)門激活TREK-2通道。(二) TREK-2的門控機制特點探索1)在甘氨酸鉸鏈水平,兩個亞基在TREK-2內(nèi)門開放過程中呈協(xié)同合作(cooperative)方式。為鑒定組成成熟TREK-2通道的兩個亞基在2-APB誘導(dǎo)的內(nèi)門開放過程中呈獨立或者合作方式,我們構(gòu)建了含有所有可能甘氨酸鉸鏈突變組合的串聯(lián)二聚體(含有兩個M2甘氨酸鉸鏈突變的除外,因為沒有功能性通道表達(dá)),并檢測它們對2-APB的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單亞基突變體(共6種)對2-APB的敏感性與野生型串聯(lián)分子(WT-WT)相似；雙亞基突變體(共5種)對2-APB的敏感性下調(diào)。這些結(jié)果表明在甘氨酸鉸鏈介導(dǎo)的內(nèi)門活動中,兩個亞基間并不是完全獨立的,野生型亞基可完全補償突變型亞基的功能,提示兩個亞基間存在相互協(xié)同合作的關(guān)系。2)外門構(gòu)象的變化依賴甘氨酸鉸鏈的活動。為確定外門構(gòu)象變化是否與甘氨酸鉸鏈活動相偶聯(lián),我們檢測了上述甘氨酸突變體對pH。變化的反應(yīng)。結(jié)果表明,與對2-APB的反應(yīng)極為相似：單亞基突變體對pH0的反應(yīng)與野生型相當(dāng)；而雙亞基突變體中,除了G196A-G312A和G312A-G196A與野生型沒有明顯區(qū)別(對2-APB的反應(yīng)也只與野生型有輕微差別),其它的均表現(xiàn)為敏感性顯著下降。這些結(jié)果提示pHo引起的外門構(gòu)象變化過程中,甘氨酸鉸鏈介導(dǎo)的內(nèi)門活動控制著外門活動,同時亞基間仍然相互合作。3)C末端近側(cè)區(qū)參與對離子選擇器構(gòu)象的調(diào)控。根據(jù)以上結(jié)果,C末端近側(cè)區(qū)與2-APB對TREK-2的結(jié)合密切相關(guān),由于該區(qū)段在其它鉀通道中通常為多種信號整合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,我們也檢測了該區(qū)段在TREK-2其它門控模型中的可能調(diào)控作用。首先,該區(qū)段缺失體表現(xiàn)為對2-APB的敏感性顯著下調(diào),與預(yù)期相符。另外,ΔpCt對pHo的敏感性也表現(xiàn)為顯著降低,提示C末端近側(cè)區(qū)也參與對離子選擇器構(gòu)象的調(diào)控,同時表明該區(qū)段為內(nèi)門和離子選擇器的公共調(diào)控元件。4)C末端以亞基協(xié)同和順式的方式調(diào)控TREK-2的內(nèi)門和外門。綜上所述,C末端在TREK-2的整個門控機制中發(fā)揮了重要的作用,但其調(diào)控的模式未知。為解決這個問題,我們首先構(gòu)建了單亞基C末端缺失體(串聯(lián)二聚體WT-△Ct和ACt-WT),并檢測它們對2-APB和pHo的反應(yīng)。結(jié)果表明,只保留一個亞基的C末端并不影響TREK-2對2-APB和pHo的敏感性,提示C末端對內(nèi)門和離子選擇器的調(diào)控為亞基協(xié)同方式。其次,進(jìn)一步突變上述串聯(lián)二聚體中野生型分子的甘氨酸鉸鏈(△Ct-G196AG312A)引起對2-APB和pHo的敏感性顯著下調(diào),表明位于不同亞基上的正常的C末端和甘氨酸鉸鏈的功能并不能相互補償,提示C末端調(diào)節(jié)內(nèi)門和離子選擇器的方式為順式機制。5)內(nèi)門活動調(diào)控離子選擇器構(gòu)象的變化。總結(jié)以上數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)在涉及甘氨酸鉸鏈和C末端的突變體中,對2-APB不敏感的也表現(xiàn)為對pHo不敏感,反之亦然。既然甘氨酸鉸鏈和C末端近側(cè)區(qū)為控制內(nèi)門活動的關(guān)鍵元件,同時根據(jù)TREK-2的結(jié)構(gòu)特點,我們認(rèn)為,在TREK-2的門控過程中,內(nèi)門起主導(dǎo)作用,離子選擇器構(gòu)象變化完全受控于內(nèi)門。二、選擇性翻譯起始(alternative translational initiation, ATI)產(chǎn)生的三個TREK-2亞型擁有相似的離子選擇器構(gòu)象已知Ba2+為檢測離子選擇器構(gòu)象變化的有效工具。由于離子選擇器序列在大多數(shù)鉀通道中保守,我們檢測了TREK-2對Ba2+的敏感性。結(jié)果如下：1)Ba2+呈濃度依賴和時間依賴的方式抑制TREK-2電流,而且這種抑制作用受到細(xì)胞外液鉀離子濃度變化的顯著影響；外門內(nèi)S4位點(第四個鉀離子結(jié)合位點)突變體T172S和T281S對Ba2+的敏感性顯著下降。以上結(jié)果表明Ba2+通過與鉀離子在S4位點的競爭結(jié)合發(fā)揮其對通道電流的抑制作用,為探測S4位點構(gòu)象變化的有效工具。2)在生理濃度K+條件下,T172S和T281S對pHo的反應(yīng)與WT相似,表明pHo引發(fā)的離子選擇器構(gòu)象變化并不涉及S4位點,而可能位于外側(cè)。3)Ba2+對ATI機制產(chǎn)生的三個TREK-2亞型的抑制率、結(jié)合和解離速率均相似,表明這些亞型與野生型在離子選擇器的最內(nèi)側(cè)(S4位點)構(gòu)象相似；同時,這三個亞型對pHo的反應(yīng)也沒有顯著差異,表明這些亞型在離子選擇器的外側(cè)構(gòu)象也相似。以上數(shù)據(jù)說明ATI機制產(chǎn)生的三種亞型擁有相似的離子選擇器構(gòu)象。另外,由于ATI產(chǎn)生的三種亞型擁有不同長度的N末端(Nt),因此,以上結(jié)果也表明TREK-2的Nt可能不參與離子選擇器構(gòu)象的調(diào)節(jié)。研究結(jié)論：(1)本研究以同源性較高的TREK-1和TREK-2通道對2-APB的敏感相差懸殊為線索,對該化合物刺激TREK-2活性的機制以及TREK-2的門控特點進(jìn)行了探討。首先,我們發(fā)現(xiàn)該化合物主要通過與位于C末端近側(cè)區(qū)的第368位組氨酸結(jié)合,并促進(jìn)內(nèi)門的開放而發(fā)揮其激活活性。隨后,我們以2-APB和pHo分別作為研究內(nèi)門和外門活動的工具,發(fā)現(xiàn)甘氨酸鉸鏈和C末端(尤其是近側(cè)區(qū))為控制內(nèi)門和離子選擇器活動的重要元件,通道的兩個亞基在門控過程中相互協(xié)同,而C末端和甘氨酸鉸鏈以順式方式(即位于同一個亞基的兩種元件)相互調(diào)控。在TREK-2的門控過程中,內(nèi)門處于主導(dǎo)地位,外門構(gòu)象的變化完全依賴內(nèi)門的活動。(2)Ba2+通過與鉀離子競爭結(jié)合于位于離子選擇器內(nèi)的第四個鉀離子結(jié)合位點而抑制TREK-2通道的開放。以Ba2+和pH0為工具,我們發(fā)現(xiàn)由選擇性翻譯起始機制產(chǎn)生的三種亞型擁有相似的離子選擇器構(gòu)象。我們的研究進(jìn)一步豐富了雙孔鉀通道的門控機制內(nèi)容,可為相關(guān)靶標(biāo)的藥物設(shè)計與開發(fā)提供理論指導(dǎo)。同時,2-APB、Ba2+和pHo可作為研究TREK-2通道或其它鉀通道結(jié)構(gòu)與功能的有效工具。
【關(guān)鍵詞】：TREK-2 2-APB Ba~(2+) pH_o 外門 內(nèi)門 門控機制
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-29
• 第一部分 TREK-2通道的內(nèi)門控制離子選擇器門的動力學(xué)特征研究29-82
• 1. 實驗材料29-39
• 2. 方法39-45
• 3. 各種突變體和缺失體構(gòu)建45-55
• 4. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計55
• 5. 結(jié)果55-82
• 5.1 質(zhì)粒構(gòu)建鑒定和表達(dá)55-56
• 5.2 C末端影響2-APB對TREK-2的作用56-60
• 5.3 C末端近側(cè)區(qū)內(nèi)的第368位組氨酸(His368)可能涉及2-APB與TREK-2的結(jié)合60-65
• 5.4 2-APB通過開放內(nèi)門激活TREK-2通道65-69
• 5.5 在甘氨酸鉸鏈水平,兩個亞基以協(xié)同的方式使內(nèi)門開放69-72
• 5.6 胞胞外pH(pH_o)變化引起的外門構(gòu)象變化依賴甘氨酸鉸鏈的運動72-75
• 5.7 TREK-2的C末端近側(cè)區(qū)參與內(nèi)門和外門的門控過程75-77
• 5.8 C末端以順式(Cis-type)和亞基協(xié)同(cooperative)方式實現(xiàn)其對門控過程的調(diào)節(jié)77-80
• 5.9 內(nèi)門和外門之間的偶聯(lián)關(guān)系80-82
• 第二部分 選擇性翻譯起始機制產(chǎn)生的TREK-2亞型擁有相似的離子選擇器構(gòu)象82-93
• 1. 實驗材料82
• 2. 方法82-83
• 3. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計83
• 4. 結(jié)果83-93
• 4.1 Ba~(2+)對TREK-2電流的抑制呈濃度和時間依賴性83-86
• 4.2 細(xì)胞外液K+濃度影響B(tài)a~(2+)對TREK-2電流的抑制86-87
• 4.3 Ba~(2+)通過結(jié)合在離子選擇器內(nèi)第四個鉀離子結(jié)合位點(S4)抑制TREK-2電流87-88
• 4.4 選擇性翻譯起始機制(ATI)產(chǎn)生的亞型的S4位點構(gòu)象相似88-90
• 4.5 ATI亞型擁有相似的離子選擇器外側(cè)構(gòu)象90-93
• 討論93-100
• 結(jié)論100-101
• 參考文獻(xiàn)101-112
• 綜述112-127
• 參考文獻(xiàn)122-127
• 攻讀學(xué)位期間成果127-128
• 英文縮略詞表128-129
• 致謝129-131
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明131

  本文關(guān)鍵詞：雙孔鉀通道TREK-2門控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：273622