本文關(guān)鍵詞：MG5的表達(dá)，鑒定以及在胃癌中的功能機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū),腫瘤標(biāo)志物,尤其是癌前預(yù)警分子和早診分子是提高胃癌生存率的重要診斷工具,但是目前尚缺乏這樣的分子標(biāo)志物。我實(shí)驗(yàn)室前期制備并初步篩選了MG5-Ab,MG7-Ab等一系列胃癌相關(guān)的單抗,顯示出很好的臨床應(yīng)用前景。但還缺乏較大規(guī)模的回顧性研究以及抗原鑒定等基礎(chǔ)性研究。目的:研究MG5在預(yù)警,早診和預(yù)后方面的臨床價(jià)值;鑒定MG5的抗原本質(zhì);探究MG5在胃癌中的生物學(xué)功能以及相關(guān)分子機(jī)制。方法:IHC法檢測(cè)MG5在大規(guī)模癌前病變(N=509;467)以及腫瘤組織中(n=747)的表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MG5表達(dá)與癌前進(jìn)展、胃癌發(fā)生、預(yù)后的相關(guān)性;WB、IP、MS、IF、慢病毒感染等方法鑒定MG5抗體特異性識(shí)別的抗原;MTT,FACS、慢病毒感染、WB、IF、Co-IP、MS、裸鼠皮下成瘤、溶酶體結(jié)合攝取等實(shí)驗(yàn)研究MG5的腫瘤生物學(xué)功能以及相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果:一、MG5在大規(guī)模胃粘膜癌前病變?nèi)巳褐械念A(yù)警作用我們將陰性表達(dá)組的疾病進(jìn)展或癌變風(fēng)險(xiǎn)設(shè)為1,相比而言,1.MG5強(qiáng)陽(yáng)性(++)和極強(qiáng)陽(yáng)性(+++)的胃黏膜病變的癌前進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)分別是3.35和5.21。2.MG5陽(yáng)性(+)和強(qiáng)陽(yáng)性(++)的癌前病變進(jìn)展為胃癌的風(fēng)險(xiǎn)分別為2.51和4.12。3.MG5陽(yáng)性(+/++)時(shí),IM/DYS病變的癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高(MG5+:2.71,MG5++:6.01)。4.MG5和H.pylori雙陽(yáng)性或MG5單獨(dú)強(qiáng)陽(yáng)性時(shí),癌前病變組織進(jìn)展為胃癌的風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加(MG5+,HP+:2.80;MG5++,HP+:3.48;MG5++:14.68)。以上陽(yáng)性結(jié)果P值均0.05。二、mg5的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義相對(duì)于癌旁組織,mg5在人類常見的八種腫瘤中表達(dá)均顯著升高(p0.05),包括食管鱗癌,胃腺癌,結(jié)腸腺癌,直腸腺癌,肺鱗癌,肺腺癌,乳腺導(dǎo)管癌,胰腺導(dǎo)管癌。mg5的表達(dá)在女性胃腺癌組織中顯著高于男性(p=0.028),還發(fā)現(xiàn)它在分化較差的乳腺導(dǎo)管癌中表達(dá)高于分化較好的癌(p=0.003)。mg5的表達(dá)與女性胃癌患者和伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),多因素回歸分析證實(shí)它是判斷這兩種患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)(p=0.015,p=0.030)。三、mg5的抗原鑒定—lamp2a我們采用胃癌細(xì)胞系sgc7901開展mg5的抗原鑒定工作,wb實(shí)驗(yàn)顯示mg5分子量大約120kd,免疫沉淀(ip)結(jié)合wb和考馬斯亮藍(lán)染色顯示mg5在120kd處明顯富集,我們?cè)?20kd處進(jìn)行切膠并進(jìn)行質(zhì)譜分析(maldi-tof/ms),結(jié)果表明mg5很可能是lamp2。wb結(jié)果顯示,商品化的lamp2抗體的確可以識(shí)別mg5抗體在120kd處的ip產(chǎn)物。由于lamp2蛋白具有a,b,c三個(gè)亞型,我們進(jìn)一步需要確定mg5對(duì)應(yīng)的是哪一種亞型。我們?cè)?93t細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)lamp2a和lamp2b,wb結(jié)果顯示商品化的lamp2抗體既可以識(shí)別lampa,也可以識(shí)別lamp2b,但mg5抗體只能識(shí)別lamp2a,表明mg5對(duì)應(yīng)的蛋白是lamp2a。lamp2a的過(guò)表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)mg5抗體識(shí)別的是lamp2a蛋白。免疫細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)表明mg5呈顆粒狀細(xì)胞器定位,并與溶酶體示蹤劑共定位于溶酶體。以上結(jié)果證實(shí),mg5是lamp2a。四、lamp2a在胃癌細(xì)胞增殖和生存中的作用及相關(guān)機(jī)制蛋白組學(xué)篩選提示,細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)蛋白rhoe可以和lamp2a和hsc70結(jié)合,提示它是伴侶分子介導(dǎo)的自噬(cma)的底物,下調(diào)lamp2a(cma也將下調(diào))可能會(huì)上調(diào)rhoe而抑制增殖。結(jié)果證實(shí),下調(diào)cma的限速分子lamp2a引起胃癌細(xì)胞的增殖減慢,同時(shí)伴有rhoe的表達(dá)增加;rhoe過(guò)表達(dá)可以直接抑制胃癌細(xì)胞的增殖;下調(diào)rhoe可以部分逆轉(zhuǎn)lamp2a下調(diào)引起的增殖抑制。rhoe是cma(伴侶分子介導(dǎo)的自噬)的底物。結(jié)果提示,通過(guò)下調(diào)lmap2a抑制cma活性后其底物蛋白rhoe水平上調(diào),是引起胃癌細(xì)胞增殖減慢的部分原因。我們的實(shí)驗(yàn)第一次闡明了CMA調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的CMA底物蛋白R(shí)hoE。另外,我們還研究了LAMP2A在胃癌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。發(fā)現(xiàn)下調(diào)LMAP2A抑制CMA活性后,細(xì)胞對(duì)H2O2誘導(dǎo)的凋亡更加敏感,過(guò)表達(dá)DJ-1可以保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)多的凋亡;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過(guò)度氧化的DJ-1是CMA的底物蛋白,CMA障礙時(shí),過(guò)度氧化的DJ-1不能有效降解發(fā)生積聚,部分介導(dǎo)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。提示正常的CMA可以有效清除過(guò)度氧化的DJ-1,從而維持胃癌細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)的生存。結(jié)論:1.MG5是篩選癌變高危人群的預(yù)警分子標(biāo)志物。2.MG5的表達(dá)與女性胃癌患者和伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),3.MG5對(duì)應(yīng)的抗原是CMA的限速分子LAMP2A。4.Rho E和過(guò)度氧化的DJ-1均是是CMA的底物蛋白,其積聚分別介導(dǎo)了CMA障礙引起的胃癌細(xì)胞的增殖減慢和抗凋亡能力減弱。
【關(guān)鍵詞】：MG5 腫瘤標(biāo)志物 抗原鑒定 增殖 凋亡 CMA Rho E DJ-1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-9
• 中文摘要9-12
• ABSTRACT12-15
• 前言15-16
• 文獻(xiàn)回顧16-31
• 第一部分: MG5在胃癌高危人群中的預(yù)警作用31-41
• 1 材料31-32
• 1.1 主要試劑及儀器31
• 1.2 組織標(biāo)本31-32
• 2 方法32-34
• 2.0 MG5單克隆抗體的大量制備及純化32-33
• 2.1 免疫組織化學(xué)（IHC）33-34
• 2.2 IHC染色評(píng)分方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34
• 3 結(jié)果34-38
• 3.1 研究對(duì)象的基本資料：34-35
• 3.2 MG5表達(dá)與基線病變的關(guān)系：35-36
• 3.3 MG5表達(dá)與胃黏膜病變轉(zhuǎn)歸的關(guān)系：36-37
• 3.4 MG5表達(dá)與胃癌發(fā)展的關(guān)系：37-38
• 4 討論38-41
• 第二部分: MG5在多種人類常見腫瘤組織中的高通量免疫組化研究41-50
• 1 材料41-42
• 1.1 組織芯片免疫組化實(shí)驗(yàn)材料41
• 1.2 腫瘤組織芯片41-42
• 2 方法42-43
• 2.1 組織芯片免疫組化（TMA-IHC）42-43
• 2.2 IHC染色評(píng)分方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析43
• 3 結(jié)果43-48
• 3.1 MG5在八種常見的腫瘤組織中的表達(dá)陽(yáng)性率43-45
• 3.2 MG5表達(dá)與腫瘤臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性45-46
• 3.3 MG5表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后的相關(guān)性分析46-48
• 4 討論48-50
• 第三部分 MG5的抗原鑒定50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 細(xì)胞系50
• 1.2 抗體及主要試劑50
• 1.3 主要儀器及耗材50-51
• 2 方法51-53
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)51
• 2.2 免疫沉淀51-52
• 2.3 Western blot52
• 2.4 質(zhì)譜分析52-53
• 2.5 細(xì)胞免疫熒光53
• 2.6 慢病毒感染53
• 3 結(jié)果MG5的抗原本質(zhì)是LMAP2A53-55
• 討論55-57
• 第四部分 MG5/LAMP2A在胃癌細(xì)胞增殖中的作用及相關(guān)分子機(jī)制57-77
• 1 材料57-59
• 1.1 細(xì)胞系57
• 1.2 抗體57-58
• 1.3 主要試劑58
• 1.4 主要儀器及耗材58-59
• 2 方法59-64
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)59
• 2.2 MTT實(shí)驗(yàn)59
• 2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)59
• 2.4 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)59
• 2.5 免疫共沉淀（Co-IP）59-60
• 2.6 Western blot60-61
• 2.7 質(zhì)譜分析61
• 2.8 慢病毒感染建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系61
• 2.9 細(xì)胞免疫熒光61-62
• 2.10 溶酶體分離純化和溶酶體攝取實(shí)驗(yàn)62-63
• 2.11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡63
• 2.12 蛋白氧化的檢測(cè)63-64
• 3 結(jié)果64-73
• 3.1 下調(diào)LAMP2A/CMA抑制胃癌細(xì)胞系的增殖64-65
• 3.2 篩選調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖的CMA底物蛋白65-67
• 3.3 下調(diào)LAMP2A引起CMA底物蛋白R(shí)ho E的水平上調(diào)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖67-70
• 3.4 下調(diào)LAMP2A導(dǎo)致氧化的DJ-1 積聚，促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 · 654 討論70-73
• 4 討論73-77
• 小結(jié)77-79
• 參考文獻(xiàn)79-101
• 附錄101-106
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果106-109
• 致謝109-110

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張積仁,張學(xué)庸,吳覺平,陳希陶,牟震先,胡家露,樊代明;檢測(cè)胃癌患者血清與胃液中MGdl-Ag的診斷價(jià)值[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1990年01期

  本文關(guān)鍵詞：MG5的表達(dá)，，鑒定以及在胃癌中的功能機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：268294