本文關鍵詞：AMPK在炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：臨床研究發(fā)現(xiàn),炎癥可能參與了非酒精性脂肪肝(NAFLD)早期的脂肪沉積過程,但機制尚未闡明。因此,在本部分的研究中,我們旨在構建炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積的動物與細胞模型,為進一步的機制研究做準備。方法：①動物模型：酪蛋白是近年來常用的小鼠慢性炎癥刺激因子,因此,我們將6-8周齡雄性C57BL/6J/、鼠隨機分為炎癥組(Casein,n=7)和對照組(NC,n=7)。炎癥組隔日皮下注射0.5 ml10%酪蛋白,對照組注射相應劑量的生理鹽水,總時間為18周。收集小鼠血清,檢測炎癥因子MCP-1、TNF-α、IL-6的水平。取小鼠肝臟組織經(jīng)油紅O染色、TG定量檢測肝臟組織脂質(zhì)沉積情況,qRT-PCR檢測肝臟脂代謝關鍵基因的表達。②細胞模型1：在體內(nèi),Kupffer細胞是肝臟炎癥的主要來源細胞,我們利用LPS刺激K.upffer細胞,檢測其炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,并用該上清液干預Hep(G2肝細胞,模擬體內(nèi)Kupffer細胞與肝細胞共生長環(huán)境,后油紅O染色、TG定量檢測HepG2肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的變化,qRT-PCR檢測肝細胞脂代謝關鍵基因的表達；③細胞模型2：TNF-α是重要的炎癥因子之一,為了建立更為單純的炎癥干預的細胞模型,我們用外源性TNF-α 20ng/mL干預HepG2細胞24h后,油紅O染色、TG定量檢測HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況,qRT-PCR以及Western blot方法檢脂質(zhì)合成關鍵基因的mRNA和蛋白水平的變化。結果：①動物模型：與對照組相比,酪蛋白注射顯著增加C57BL/6J小鼠血中炎癥因子MCP-1、TNF-α、IL-6的水平,肝臟脂質(zhì)沉積明顯,脂代謝紊亂。②細胞模型1：LPS刺激明顯增加Kupffer細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,上清液干預HepG2細胞后,細胞脂質(zhì)含量顯著增加,脂代謝異常。③細胞模型2：與對照組相比,TNF-α促進HepG2肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積,脂質(zhì)合成關鍵基因SREBP1、FAS的表達明顯升高。結論：成功構建炎癥誘導的肝脂質(zhì)沉積的動物與細胞模型。目的：腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated protein kinase,AMPK)是生物體內(nèi)重要的能量感受器,參與脂代謝過程。在第一部分的研究中,我們已經(jīng)觀察到炎癥誘導肝臟脂質(zhì)沉積。然而,在此過程中,AMPK通路是否發(fā)揮作用尚不清楚。因此,本部分的研究旨在炎癥誘導的脂質(zhì)沉積模型中,探討AMPK通路的作用以及可能的機制,為非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。方法：estern blotting檢測第一部分研究建立的炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積的動物與細胞模型中MPK以及下游ACC的磷酸化水平以反映AMPK通路激活情況；②探討AMPK通路是否介導了炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積：在TNF-a誘導的HepG2肝細胞模型中,加用AMPK激動劑二甲雙胍1mM或AICAR 1mM,或二甲雙胍1mM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C 40μM,干預24h后,通過油紅O染色、TG定量檢測觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；Western blotting和qRT-PCR檢測細胞AMPK/mTOR/SREBP1通路的表達變化。結果：①與對照組相比,炎癥小鼠肝臟組織AMPK以及下游ACC的磷酸化水平降低；Kupffer細胞上清液干預肝細胞后,肝細胞AMPK以及ACC磷酸化明顯減少；在TNF-α作用下,HepG2細胞AMPK以及ACC磷酸化顯著降低。②在TNF-α誘導的肝細胞脂質(zhì)沉積模型中,加用二甲雙胍或AICAR后,細胞內(nèi)TG含量顯著降低,脂質(zhì)沉積得到改善,進一步檢測發(fā)現(xiàn),AMPK以及ACC磷酸化水平明顯增加,AMPK激活增多, mTORSer2448以及p70S6K Thr421/Ser424位點的磷酸化水平顯著降低,脂質(zhì)合成關鍵基因SREBP1、FAS的表達顯著減少；而加入二甲雙胍聯(lián)合Compound C后,AMPK以及ACC磷酸化水平降低,AMPK激活減少,mTORSer2448以及pThr421/Ser424位點的磷酸化水平顯著增加,SREBP1、FAS的表達顯著升高,TG含量增加,明顯減弱二甲雙胍對脂質(zhì)沉積的改善作用。結論：AMPK磷酸化水平在炎癥誘導的脂質(zhì)沉積過程中顯著降低,AMPK/mTOR/SREBP1通路可能介導了TNF-α誘導HepG2肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚過程。
【關鍵詞】：炎癥 脂質(zhì)沉積 脂代謝 Kupffer細胞 TNF-α AMPK 炎癥 脂質(zhì)沉積 mTOR SREBP1
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 第一部分 炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積模型的建立18-48
• 1 實驗材料18-22
• 2 實驗方法22-35
• 3 實驗結果35-45
• 4 討論45-48
• 第二部分 AMPK在炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用以及可能的機制48-59
• 1 實驗材料48-49
• 2 實驗方法49-50
• 3 實驗結果50-57
• 4 討論57-59
• 參考文獻59-64
• 全文總結64-65
• 文獻綜述65-81
• 參考文獻74-81
• 致謝81-82
• 攻讀學位期間的研究成果及發(fā)表的學術論文目錄82

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本文編號：266492