本文關(guān)鍵詞：活性氧與SLE外周血單核細胞來源的樹突狀細胞細胞因子分泌、抗原遞呈能力的關(guān)聯(lián)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種累及多系統(tǒng)、多器官、臨床表現(xiàn)復雜、病程遷延反復的自身免疫性疾病,對患者的身心健康造成較大危害,是一個重要的公共衛(wèi)生問題。盡管SLE的發(fā)病機制未完全闡明,但已有的證據(jù)表明,疾病的發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān),引起機體免疫異常,尤其是免疫細胞表達和(或)功能紊亂:如對自身抗原的耐受失衡,自身反應(yīng)性的T淋巴細胞和B淋巴細胞活化紊亂,細胞因子功能發(fā)揮失控以及針對抗雙鏈DNA、核小體、核蛋白的自身抗體過度產(chǎn)生。由此導致的自身反應(yīng)性抗體大量聚集會引起補體活化、免疫復合物沉積,最終引起組織和(或)器官損傷。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)廣泛表達于體內(nèi),通常起著免疫監(jiān)視、抗原遞呈和免疫耐受的作用。DC作為特殊的“哨兵細胞”,在固有免疫與適應(yīng)性免疫間起著重要的橋梁作用。DC表達特殊的模式識別受體,如Toll樣受體,C型凝集素受體,RIG-I樣受體以及NOD樣受體。DC通�？梢苑譃閮纱箢�:漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid DC,p DC)和常規(guī)樹突狀細胞(conventional DC,c DC)。DC的模式識別受體通過結(jié)合到微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern molecules,PAMPs)或者內(nèi)源性分子的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs),以捕獲抗原。當DC成功捕獲抗原后,DC將歷經(jīng)成熟:(1)上調(diào)表面分子和共刺激分子的表達;(2)啟動和調(diào)節(jié)T淋巴細胞和B淋巴細胞的功能;(3)分泌一些細胞因子,從而調(diào)控和極化其他效應(yīng)分子的功能。DC可以通過幾種方式影響SLE的發(fā)病,如遞呈自身抗原給自身反應(yīng)性T淋巴細胞,產(chǎn)生促炎性細胞因子。SLE與MHC單倍體顯著相關(guān),表明T淋巴細胞應(yīng)答在疾病的形成中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)狼瘡鼠體內(nèi)TLR7過表達會加劇疾病的發(fā)生、發(fā)展,這一過程與固有刺激啟動相關(guān),并且完全依賴于MHC單倍型,提示DC可能參與了遞呈染色質(zhì)和RNA相關(guān)的蛋白質(zhì)給自身反應(yīng)性T淋巴細胞�；罨腸 DC能產(chǎn)生IL-12p70,而IL-12p70會促進T淋巴細胞中IFNγ的形成,這將導致初始T淋巴細胞分化成Th1細胞;p DC能產(chǎn)生I型干擾素,而I型干擾素會促進c DC成熟,降低使Toll樣受體活化的閾值。因此,DC在SLE發(fā)病中可以通過影響炎癥性細胞因子的產(chǎn)生而起作用。活性氧(reactive oxygen species,ROS)包括很多分子實體,如非自由基氧化劑H2O2,NO衍生的過氧亞硝酸鹽,或者含未成對電子的自由基,如羥基自由基、NO和超氧。細胞內(nèi)的NADPH氧化酶在受到外界刺激后會產(chǎn)生ROS,胞內(nèi)物質(zhì)如過氧化物酶和線粒體在氧代謝時所產(chǎn)生的生化反應(yīng)也會產(chǎn)生ROS。已有研究表明,ROS對信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮直接作用,從而對細胞運動、分化和凋亡產(chǎn)生重要影響。ROS能夠誘導DC成熟,影響DC分泌促炎性細胞因子。DC內(nèi)含有像NADPH氧化酶那樣發(fā)揮作用所需的物質(zhì)。當DC與微生物成分或同源T淋巴細胞相互作用時,DC產(chǎn)生ROS。因此,ROS可能作為DC的內(nèi)源性調(diào)節(jié)體影響DC的功能發(fā)揮。已有報道,ERK(extracellular regulated protein kinases)通路是MAPK通路中高度保守的通路,參與了多種細胞功能的發(fā)揮。ERK及其磷酸化的形態(tài)、ROS在SLE中表達異常,與疾病活動度相關(guān),但現(xiàn)有的研究并未揭示單核細胞來源的樹突狀細胞(monocytes-induced dendritic cells,mo DC)中磷酸化的ERK(phosphorylation of ERK,p ERK)、ROS表達是否異常,mo DC分泌的炎癥性細胞因子是否異常,p ERK的表達是否與ROS相關(guān),炎癥性細胞因子的分泌是否與ROS相關(guān),ROS會否經(jīng)p ERK通路影響炎癥性細胞因子的分泌。此外,本研究將探討mo DC的抗原遞呈能力,以Th17細胞分化為例,推測其抗原遞呈能力是否改變,且是否與ROS相關(guān)。這些研究將增進對mo DC內(nèi)ROS表達和(或)功能的了解。第一部分SLE患者外周血單核細胞來源的樹突狀細胞內(nèi)ROS表達研究目的從人外周血中提取出單核細胞誘導成樹突狀細胞后,比較SLE患者(新發(fā)病例,病情穩(wěn)定期病例)和正常對照的樹突狀細胞內(nèi)ROS表達水平差異,以探索ROS與SLE之間的關(guān)聯(lián)。方法在獲取研究對象知情同意后采用自行設(shè)計的問卷進行調(diào)查,同時抽取15ml抗凝外周靜脈血,經(jīng)淋巴細胞分離液分選出外周血單個核細胞,通過磁珠分選的方法提取出單核細胞,經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導劑(rh GM-CSF+rh IL-4)培養(yǎng)7天,測定mo DC內(nèi)ROS表達水平:收集SLE病例20例(新發(fā)病例11例,病情穩(wěn)定期病例9例),健康對照20例;病例和對照組各分為LPS刺激組和未刺激組�；驈娜送庵苎蟹蛛x出單核細胞后,經(jīng)含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天,測定mo DC內(nèi)ROS表達水平:收集SLE病例10例(新發(fā)病例5例,病情穩(wěn)定期病例5例),健康對照10例;病例和對照組各分為LPS刺激組和未刺激組。采用SPSS10.01軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。病例與對照數(shù)據(jù)進行比較時,符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗,不符合正態(tài)分布者采用Man-Whitney U檢驗。以P0.05作為統(tǒng)計學差異的標準。結(jié)果(1)經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導劑(rh GM-CSF+rh IL-4)培養(yǎng)mo DC時:20例SLE病例均為女性;20例健康對照中,女性19例、男性1例。病例組平均年齡為32.0±7.9歲(年齡分布從20到44歲);健康對照組平均年齡為34.1±12.8歲(年齡分布從22到59歲)。①健康對照與病情穩(wěn)定期病例做比較時,mo DC未經(jīng)LPS刺激,ROS表達水平在兩者間比較的P=0.402;moDC經(jīng)LPS刺激時,P=0.566。②健康對照與新發(fā)病例做比較時,mo DC未經(jīng)LPS刺激,ROS表達水平在兩者間比較的P=0.358;mo DC經(jīng)LPS刺激時,P=0.670。③不考慮疾病活動度,將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體,與健康對照做比較時,mo DC未經(jīng)LPS刺激,ROS表達水平在兩者間比較的P=0.194;mo DC經(jīng)LPS刺激時,P=0.646。④考慮LPS刺激前后對健康對照或SLE病例自身mo DC的影響:健康對照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平,與健康對照經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平做比較,即健康對照與病情穩(wěn)定期病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較,P=0.441;健康對照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平,與健康對照經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平做比較,即健康對照與新發(fā)病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較,P=0.075。不考慮疾病活動度,將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體:健康對照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平,與健康對照經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平做比較,即所有健康對照與所有SLE病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較,P=0.062。(2)經(jīng)含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)mo DC時:10對SLE病例和健康對照中,女性均為9例、男性各1例。病例組平均年齡為33.3±9.1歲(年齡分布從20到48歲);健康對照組平均年齡為32.7±8.9歲(年齡分布從23到48歲)。①健康對照與病情穩(wěn)定期病例做比較時,mo DC未經(jīng)LPS刺激,ROS表達水平在兩者間比較的P=0.064;mo DC經(jīng)LPS刺激時,P=0.834。②健康對照與新發(fā)病例做比較時,mo DC未經(jīng)LPS刺激,ROS表達水平在兩者間比較的P=0.530;mo DC經(jīng)LPS刺激時,P=0.292。③不考慮疾病活動度,將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體,與健康對照做比較時,mo DC未經(jīng)LPS刺激,ROS表達水平在兩者間比較的P=0.791;mo DC經(jīng)LPS刺激時,P=0.496。④考慮LPS刺激前后對健康對照或SLE病例自身mo DC的影響:健康對照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平,與健康對照經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平做比較,即健康對照與病情穩(wěn)定期病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較,P=0.447;健康對照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平,與健康對照經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平做比較,即健康對照與新發(fā)病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較,P=0.293。不考慮疾病活動度,將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體:健康對照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平,與健康對照經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達水平做比較,即所有健康對照與所有SLE病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較,P=0.821。結(jié)論本研究表明:SLE病例與健康對照外周血單核細胞來源的樹突狀細胞,其ROS表達水平在兩組間無顯著性差異。第二部分ROS與樹突狀細胞炎癥性細胞因子分泌的關(guān)聯(lián)研究目的比較SLE患者(新發(fā)病例)和正常對照的樹突狀細胞內(nèi)p ERK表達水平及分泌的炎癥性細胞因子差異。分析ROS與p ERK及炎癥性細胞因子間的關(guān)聯(lián)。方法經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導劑(rh GM-CSF+rh IL-4)、含SLE血清的培養(yǎng)基兩種方法培養(yǎng)新發(fā)病例與健康對照的mo DC時(前者為11對,后者為5對),收集上清液,-80℃凍存留待檢驗。采用ELISA試劑盒檢測上清液中與Th1,Th2,Th17相關(guān)的炎癥性細胞因子IL-2,IL-6,IL-10,IL-17的表達水平。新發(fā)病例和健康對照各分為LPS刺激組和未刺激組。此外,收集經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導劑(rh GM-CSF+rh IL-4)培養(yǎng)的新發(fā)病例與健康對照的mo DC(11對,未經(jīng)LPS刺激),裂解細胞,經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測病例組與對照組間p ERK表達水平。分析ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、p ERK表達水平之間的關(guān)聯(lián)。本研究所采用的病例組、對照組細胞來自于第一部分培養(yǎng)的細胞。數(shù)據(jù)的分析采用SPSS10.01軟件進行,以α=0.05為檢驗水準。結(jié)果(1)兩種方法培養(yǎng)mo DC時,新發(fā)病例與健康對照的mo DC,無論經(jīng)LPS刺激還是未刺激,IL-2、IL-6、IL-10、IL-17的表達水平在二者間均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導劑培養(yǎng)mo DC時,新發(fā)病例組與健康對照組的mo DC未經(jīng)LPS刺激,p ERK表達水平在病例組中明顯低于健康對照組(P=0.031)。(3)ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、pERK表達水平間均無顯著性關(guān)聯(lián)(P0.05);此外,p ERK表達水平與炎癥性細胞因子表達水平間無統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)(P0.05)。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn):與Th1,Th2,Th17相關(guān)的炎癥性細胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-17在新發(fā)病例與健康對照間無統(tǒng)計學差異,但p ERK表達水平在新發(fā)病例組中明顯低于健康對照。然而炎癥性細胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IL-17)的分泌可能與ROS無關(guān)聯(lián)。第三部分ROS與樹突狀細胞抗原遞呈能力關(guān)聯(lián)探討,以Th17分化為例目的將新發(fā)病例與健康對照的單核細胞培養(yǎng)成樹突狀細胞(mo DC),然后分別與健康對照的CD4+T細胞進行共培養(yǎng),以探討mo DC的抗原遞呈能力,以Th17分化為例。分析ROS表達水平與Th17分化間的關(guān)系,以推測mo DC抗原遞呈能力的改變是否與ROS相關(guān)。方法新發(fā)病例和健康對照的單核細胞經(jīng)含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天(新發(fā)病例和健康對照各5例);獲mo DC后,分為不同的濃度組,再與健康對照(同一人)的T細胞(濃度恒定)進行共培養(yǎng)6天,然后用ELISA法檢測上清液中與Th17分化相關(guān)的炎癥性細胞因子TGF-β、IL-6的表達水平;流式細胞儀檢測Th17細胞的表達水平在二者間的差異。分析ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、Th17細胞表達水平的關(guān)聯(lián)。本研究所采用的病例組、對照組細胞來自于第一部分培養(yǎng)的細胞。數(shù)據(jù)的分析采用SPSS10.01軟件進行,以α=0.05為檢驗水準。結(jié)果(1)新發(fā)病例、健康對照的mo DC,分別與同一健康對照的CD4+T細胞共培養(yǎng)后,TGF-β、IL-6的表達水平在二者間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)新發(fā)病例、健康對照的mo DC,分別與同一健康對照的CD4+T細胞共培養(yǎng)后,Th17細胞的表達水平在二者間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、Th17細胞表達水平間均無顯著性關(guān)聯(lián)(P0.05)。結(jié)論本研究表明:mo DC的抗原遞呈能力在病例組與健康對照組間無顯著性差異(以Th17研究為例),mo DC抗原遞呈能力的變化(誘導Th17分化)可能與ROS無關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡 外周血單核細胞來源的樹突狀細胞 ROS 胞內(nèi)表達 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 pERK 炎癥性細胞因子 活性氧 相關(guān)性 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 Th17細胞 炎癥性細胞因子 活性氧 相關(guān)性
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-15
• 英文摘要15-24
• 第一部分 SLE患者外周血單核細胞來源的樹突狀細胞內(nèi)ROS表達研究24-57
• 1. 前言24-26
• 2. 材料與方法26-41
• 3. 結(jié)果41-47
• 4. 討論47-51
• 參考文獻51-57
• 第二部分 ROS與樹突狀細胞炎癥性細胞因子分泌的關(guān)聯(lián)研究57-87
• 1. 前言57-58
• 2. 材料與方法58-71
• 3. 結(jié)果71-80
• 4. 討論80-83
• 參考文獻83-87
• 第三部分 ROS與樹突狀細胞抗原遞呈能力關(guān)聯(lián)探討，以Th17分化為例87-111
• 1. 前言87-88
• 2. 材料與方法88-96
• 3. 研究結(jié)果96-103
• 4. 討論103-106
• 結(jié)論106-107
• 創(chuàng)新性及不足之處107
• 參考文獻107-111
• 附錄111-114
• 致謝114-115
• 綜述115-131
• 參考文獻123-131
• 附件131-133

  本文關(guān)鍵詞：活性氧與SLE外周血單核細胞來源的樹突狀細胞細胞因子分泌、抗原遞呈能力的關(guān)聯(lián)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：266227