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肝竇內(nèi)皮旁分泌MIF促進(jìn)肝內(nèi)預(yù)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞的趨化和生長(zhǎng)

發(fā)布時(shí)間：2017-03-20 10:01

本文關(guān)鍵詞：肝竇內(nèi)皮旁分泌MIF促進(jìn)肝內(nèi)預(yù)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞的趨化和生長(zhǎng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的結(jié)直腸癌患者最主要的死亡原因是由于發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移,大約有三分之一被確診為結(jié)直腸癌的患者在3年內(nèi)會(huì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移¨。只有25%伴有孤立肝轉(zhuǎn)移病灶的結(jié)直腸癌患者能進(jìn)行有效的手術(shù)切除治療,并且僅有21%-48%的患者術(shù)后生存期超過(guò)5年。結(jié)直腸癌患者治療失敗和死亡的主要原因是發(fā)生轉(zhuǎn)移且形成了轉(zhuǎn)移瘤。Paget在1889年提出的“種子與土壤”假說(shuō)已經(jīng)為我們研究結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了指導(dǎo)方向,腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中的支持細(xì)胞及它們所產(chǎn)生細(xì)胞因子的相互作用,共同參與了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。2003年Fidler修正的“種子與土壤”假說(shuō)已經(jīng)明確提出了轉(zhuǎn)移瘤的形成是靶器官微環(huán)境相關(guān)因子與轉(zhuǎn)移細(xì)胞協(xié)同作用的產(chǎn)物,抗轉(zhuǎn)移治療不僅要靶向阻斷腫瘤細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移特性,而且應(yīng)該對(duì)抗靶器官微環(huán)境中適應(yīng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的多種細(xì)胞與細(xì)胞因子,才可能防止和對(duì)抗惡性腫瘤轉(zhuǎn)移。肝臟被認(rèn)為是結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移靶器官,其內(nèi)微環(huán)境非常適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,因此,探討其與結(jié)直腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移之間密切相關(guān)的因素尤為重要。本課題通過(guò)比較結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移靶器官(肝)及非靶器官內(nèi)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞之間相互的趨化作用,篩選和鑒定與腫瘤細(xì)胞作用密切的關(guān)鍵細(xì)胞和細(xì)胞因子,闡明其調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移行為的分子機(jī)制,針對(duì)腫瘤細(xì)胞和靶器官微環(huán)境協(xié)同作用的細(xì)胞因子進(jìn)行治療,以獲得抗種子和抗土壤的雙重抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療。研究方法1.篩選結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移靶器官(肝)與腫瘤細(xì)胞之間起趨化作用的關(guān)鍵細(xì)胞。我們首先評(píng)估了結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移靶器官(肝)來(lái)源的與非靶器官來(lái)源的正常細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的趨化作用。應(yīng)用Transwell遷移小室實(shí)驗(yàn)來(lái)比較正常細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞的趨化作用,將人正常的細(xì)胞分別置入遷移小室的下層,結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW480、HCT116和LS 1 74T)分別鋪在遷移小室的上層。人肝內(nèi)的正常細(xì)胞包括HHSECs(人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞)、HL7702(人肝細(xì)胞)和LX-2(人肝星狀細(xì)胞),非靶器官來(lái)源的正常細(xì)胞包括HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、293A(人胚腎細(xì)胞)和BJ(人包皮成纖維細(xì)胞)。隨后將正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的位置互換,HHSECs、HUVECs, HL7702和LX-2細(xì)胞置于小室的上層,結(jié)直腸癌細(xì)胞置于小室的下層,觀察腫瘤細(xì)胞是否具有趨化正常細(xì)胞遷移的能力。2.篩選轉(zhuǎn)移靶器官肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(HHSECs)趨化腫瘤細(xì)胞遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子。收集Transwell、室上室和下室的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,利用含有1000種人細(xì)胞因子抗體芯片篩選出HHSECs趨化腫瘤細(xì)胞遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子-白細(xì)胞游走抑制因子(MIF)。用含有MIF干擾片段的shRNA構(gòu)建的慢病毒載體包被的病毒顆粒分別轉(zhuǎn)染HHSECs和結(jié)直腸癌細(xì)胞,以建立穩(wěn)定干擾MIF表達(dá)的細(xì)胞株。利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)技術(shù)、免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)和酶鏈免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)在細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)以及外分泌水平檢測(cè)干擾效率。最后再通過(guò)Transwell小室,利用Mock/HHSECs條件培養(yǎng)基,shMIF/HHSECs條件培養(yǎng)基,Mock/HHSECs條件培養(yǎng)基加入p425(MIF特異性抑制劑)以及shMIF/HHSECs條件培養(yǎng)基中加入rhMIF(重組人白細(xì)胞游走抑制因子)分別誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞和干擾了MIF表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞,驗(yàn)證在HHSECs趨化腫瘤細(xì)胞遷移的過(guò)程中是HHSECs旁分泌的ME而非腫瘤細(xì)胞來(lái)源的MIF起到了關(guān)鍵的作用。3. HHSECs旁分泌MIF對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)影響。(1)普通光學(xué)顯微鏡觀察用培養(yǎng)了HHSECs細(xì)胞的條件培養(yǎng)基再培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的改變。(2)運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HHSECs趨化腫瘤細(xì)胞時(shí)發(fā)生遷移和未發(fā)生遷移的細(xì)胞是否發(fā)生上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)。(3)通過(guò)免疫蛋白印跡法驗(yàn)證HHSECs外分泌的MIF誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。(4)利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)和EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)HHSECs旁分泌的MIF對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。(5)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定HHSECs旁分泌的MIF對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。4.體內(nèi)驗(yàn)證HHSECs旁分泌的MIF對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。(1)原位移植裸鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型用來(lái)確定是否HHSECs分泌的MIF能影響CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和肝轉(zhuǎn)移。CRC細(xì)胞,CRC細(xì)胞混合Mock/HHSECs,CRC細(xì)胞混合shMIF/HHSECs和HHSECs分別接種至裸鼠盲腸漿膜下,觀察HHSECs分泌的MIF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響。(2)將Mock/HHSECs和shMIF/HHSECs分別與干擾了MIF表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞共同種植于BALB/c-Nude裸鼠背部皮下,進(jìn)一步證實(shí)HHSECs外分泌的MIF對(duì)腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)的影響。5.分析MIF與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的相互關(guān)系。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MIF在229例從南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科收集的結(jié)直腸癌組織樣本中的表達(dá)情況,結(jié)合患者的臨床病理特征,探討HHSECs分泌的MIF與結(jié)直腸癌及肝轉(zhuǎn)移瘤的關(guān)系。6.探討HHSECs旁分泌的MIF趨化結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的機(jī)制。利用免疫蛋白印跡法及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HHSECs分泌的MIF刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白及相關(guān)調(diào)節(jié)因子的改變。研究結(jié)果1.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是趨化結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵細(xì)胞。我們先評(píng)估是否來(lái)自肝臟和非特異性靶器官的正常細(xì)胞對(duì)CRC細(xì)胞遷移是否有不同影響。應(yīng)用Transwell遷移小室來(lái)比較正常細(xì)胞對(duì)CRC細(xì)胞趨化的能力,我們將人類正常細(xì)胞放置在下層小室,分別將CRC細(xì)胞(SW480,HCT116和LS174T)放置在上層小室。肝臟的正常細(xì)胞包括]HHSECs,HL7702(人肝細(xì)胞)和LX-2(人肝星狀細(xì)胞)和源自非特異性靶器官的對(duì)照細(xì)胞如：HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞),293A(人胚胎腎細(xì)胞)和BJ(人包皮成纖維細(xì)胞)進(jìn)行比較。該模型模擬了肝血竇內(nèi)預(yù)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞被相鄰的細(xì)胞趨化的一個(gè)過(guò)程。結(jié)果表明,HHSECs誘導(dǎo)CRC發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量是HUVECs誘導(dǎo)的3-14倍(F=1929.169 P0.001),HL7702、LX-2、HL7702、293A、LX-2和BJ細(xì)胞誘導(dǎo)CRC細(xì)胞的遷移的能力同空白對(duì)照組并沒(méi)有顯著差異。來(lái)源于轉(zhuǎn)移靶器官的細(xì)胞,如HL7702和LX-2,對(duì)CRC細(xì)胞的遷移能力同來(lái)自非靶器官的細(xì)胞,如293A(F=0.352 P=0.705)和BJ(F=0.071 P=0.931)相比,并沒(méi)有積極顯著的促進(jìn)作用。隨后,我們將Transwell小室中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的位置發(fā)生對(duì)換,置于下層小室的CRC細(xì)胞并沒(méi)有趨化置于上層小室的]HHSECs(F=2.717 P=0.052), HUVECs (F=0.155 P=0.926),HL7702 ((F=56.366 P0.001,由于細(xì)胞遷移數(shù)均數(shù)較少,實(shí)際比較的意義并不大)和LX-2(F=1.288 P=0.282)發(fā)生顯著的遷移。此外,當(dāng)HHSECs. HL7702和LX-2細(xì)胞混合培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)CRC細(xì)胞遷移時(shí),混合細(xì)胞的化學(xué)趨化作用并不強(qiáng)于單獨(dú)用HHSECs趨化。另外,我們也把以轉(zhuǎn)移到肝臟為特定目標(biāo)器官的腫瘤細(xì)胞,HCC1937(人類乳腺癌細(xì)胞),作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,把另一基本不轉(zhuǎn)移到肝臟的腫瘤細(xì)胞,RL95(子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞)作為陰性對(duì)照,用HHSECs、HL7702和LX-2細(xì)胞來(lái)分別誘導(dǎo),有趣的是,HHSECs誘導(dǎo)HCC1937(F=687.850 P0.001)遷移的能力顯著強(qiáng)于RL95 (F=1.407 P=0.244),但乳腺癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞并沒(méi)有趨化HHSECs (F=2.753 P=0.072)或HUVECs (F=2.533 P=0.087)遷移的能力。因此,Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證明HHSECs是趨化CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移到特定目標(biāo)器官一肝臟的關(guān)鍵細(xì)胞。2.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌的MIF是趨化結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的重要因子。為了確定HHSECs可能會(huì)釋放哪些介導(dǎo)因子誘導(dǎo)CRC細(xì)胞發(fā)生明顯遷移,我們收集Transwell上室和下室內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液(條件培養(yǎng)基),用包含1000種抗體的人類細(xì)胞因子陣列檢測(cè)。我們分析了抗體陣列檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),MIF、 IGFBP-7、Smad 4、SPARC、thrombospondin口Ras的表達(dá)在HHSECs培養(yǎng)基中顯著高于HUVECs和CRC細(xì)胞培養(yǎng)基(F=583.395 P0.001)。這些蛋白中,HHSECs條件培養(yǎng)基同HUVECs、SW480和HCT116細(xì)胞培養(yǎng)基相比,MIF的表達(dá)是最高的。兩種MIF特異性的抑制劑(ISO-1和p425)能抑制HHSECs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞遷移。作為陽(yáng)性對(duì)照,在培養(yǎng)基中加入rhMIF(人類重組MIF)后,CRC細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。為了評(píng)價(jià)HHSECs外分泌的MIF介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的趨化作用,我們用慢病毒包裝的發(fā)夾式RNA(shRNA)干擾HHSECs內(nèi)MIF的表達(dá)。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR),蛋白免疫印跡(WB)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)驗(yàn)證干擾細(xì)胞內(nèi)和外分泌MIF表達(dá)的效率。我們發(fā)現(xiàn),Mock/HHSECs條件培養(yǎng)基中加入MIF的抑制劑p425(100 nM)或shMIF/HHSECs條件培養(yǎng)基能抑制HHSECs誘導(dǎo)的遷移作用,但這種抑制作用可以通過(guò)補(bǔ)充rhMIF(50 nM)得到恢復(fù)。為了闡明HHSECs分泌的MIF還是CRC細(xì)胞的MIF在趨化遷移過(guò)程中起主要作用,我們干擾了SW480和HCT116細(xì)胞內(nèi)MIF的表達(dá)。Mock/HHSECs趨化shMIF/SW480和shMIF/HCT116遷移能力顯著強(qiáng)于shMIF/HHSECs和Mock/HHSECs加上p425的誘導(dǎo)作用(F=1653.369 P0.001)。我們也運(yùn)用WB和ELISA檢測(cè)是否在其他轉(zhuǎn)移性微環(huán)境中的細(xì)胞也表達(dá)或外分泌MIF,包括HL7702、LX-2和HUVECs。 HL7702,LX-2和HUVECs在細(xì)胞內(nèi)也表達(dá)MIF,但是外分泌少量的MIF。我們運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增并檢測(cè)了MIF在HHSECs、SW480、HCT116和HUVECs由mRNA的編碼序列,發(fā)現(xiàn)它們的序列是一致的。因此,HHSECs分泌的MIF是介導(dǎo)HHSECs趨化CRC細(xì)胞遷移的一個(gè)關(guān)鍵因子。3.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌的MIF促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT,增殖以及凋亡抵抗。當(dāng)CRC細(xì)胞用HHSECs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后,CRC細(xì)胞胞質(zhì)突起形成海星樣的形狀。Transwell遷移模型用來(lái)展示HHSECs趨化CRC細(xì)胞發(fā)生遷移的過(guò)程中是否發(fā)生了EMT。我們發(fā)現(xiàn)HHSECs誘導(dǎo)發(fā)生遷移的CRC細(xì)胞同未發(fā)生遷移的CRC細(xì)胞相比,強(qiáng)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,如N-鈣粘著蛋白(N-ca)和波形蛋白(VIM),弱表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘著蛋白(E-ca)。為了確認(rèn)EMT的發(fā)生是否由HHSECs分泌的MIF介導(dǎo),我們用各種不同的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)CRC細(xì)胞24小時(shí),WB檢測(cè)表明,在包含更多的可溶性MIF的條件培養(yǎng)基中,CRC細(xì)胞N-ca和VIM表達(dá)增強(qiáng),E-ca表達(dá)減弱。運(yùn)用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)旁分泌的MIF對(duì)CRC細(xì)胞增殖能力的影響,SW480和HCT116細(xì)胞用不同的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。CCK8測(cè)定結(jié)果表明,含有較高濃度外分泌的MIF條件培養(yǎng)基有利于CRC細(xì)胞的增殖,這與EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果相一致。為了探討旁分泌的MIF促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制,我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了MIF對(duì)細(xì)胞周期的影響。旁分泌的MIF能顯著增加G2期的細(xì)胞比例(F=79.827 P0.001),但對(duì)細(xì)胞G1期和S期影響不明顯。此外,我們運(yùn)用膜聯(lián)蛋白V染色作為凋亡的指標(biāo)用來(lái)衡量凋亡對(duì)增殖的影響�？扇苄訫IF能夠抑制5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)CRC細(xì)胞的凋亡(F=205.862 P0.001)�？偟膩�(lái)說(shuō),這些數(shù)據(jù)提示HHSECs旁分泌的MIF在誘導(dǎo)CRC細(xì)胞遷移時(shí)能激活EMT,促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞增殖和凋亡抵抗。4.HHSECs旁分泌的MIF有利于結(jié)直腸癌在體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。原位移植裸鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型用來(lái)確定HHSECs旁分泌的MIF對(duì)CRC細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和肝轉(zhuǎn)移的影響。CRC細(xì)胞,CRC細(xì)胞混合Mock/HHSECs,CRC細(xì)胞混合shMIF/HHSECs和HHSECs分別接種至裸鼠盲腸漿膜下,觀察8周。裸鼠被安樂(lè)死后,進(jìn)行大體標(biāo)本和顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,CRC細(xì)胞混合Mock/HHSECs接種組,結(jié)直腸原位瘤的大小、腫瘤生長(zhǎng)的速度、體積、重量和形成腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量,以及在大體和顯微鏡下觀察,肝和肺內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量(x2=11.356 P0.001)都比單獨(dú)接種CRC細(xì)胞組,或CRC細(xì)胞與shMIF/ HHSECs混合接種組顯著增加。然而,HHSECs單獨(dú)接種,本身并不產(chǎn)生任何腫塊。此外,shMIF/SW480細(xì)胞,shMIF/SW480細(xì)胞混合Mock/HHSECs,或shMIF/SW480細(xì)胞混合shMIF/HHSECs接種至裸鼠皮下,結(jié)果表明,Mock/ HHSECs細(xì)胞分泌的MIF能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和腫瘤的生長(zhǎng) (F=13.909P=0.004)�？傊�,這些結(jié)果表明HHSECs分泌MIF能促進(jìn)CRC細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤和轉(zhuǎn)移。5.MIF與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)相關(guān)。我們用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MIF蛋白在CRC病人原位瘤樣本的表達(dá)情況,229例CRC患者的樣本來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科。結(jié)果顯示,MIF在原位瘤的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲、組織學(xué)分期、患者的生存時(shí)間、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并沒(méi)有顯著相關(guān)性。因此,原位瘤微環(huán)境中CRC細(xì)胞來(lái)源的MIF或其它不確定細(xì)胞來(lái)源的MIF對(duì)腫瘤的預(yù)轉(zhuǎn)移并沒(méi)有起到重要的作用。我們還利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)了MIF在29位CRC患者原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移管狀腺癌的配對(duì)樣本中的表達(dá)。根據(jù)MIF在原位腫瘤和肝轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)的不同,我們將所有配對(duì)的樣本分為兩組。A組包括MIF的表達(dá)水平在原位瘤中低于肝轉(zhuǎn)移瘤,而B(niǎo)組包括MIF的表達(dá)水平的樣本在原位瘤中高于或等于肝轉(zhuǎn)移瘤。29對(duì)配對(duì)樣本分析,A組中0例(0%)和B組中5例(45%)患者的肝轉(zhuǎn)移瘤最大直徑小于3 cm(P0.05)：A組中18例(100%)和B組中6例(55%)患者的肝轉(zhuǎn)移瘤最大直徑大于或等于3 cm(P0.05)。這些結(jié)果表明,肝轉(zhuǎn)移瘤的大小和MIF的表達(dá)呈正相關(guān),提示HHSECs對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。6. HHSECs旁分泌的MIF誘導(dǎo)CRC細(xì)胞遷移通過(guò)磷酸化cofilin調(diào)節(jié)F-actin。闡明旁分泌MIF誘導(dǎo)CRC細(xì)胞遷移所涉及的信號(hào)通路是至關(guān)重要的。我們用之前的方法將CRC細(xì)胞用條件培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用Mock/HHSECs的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)與其他條件培養(yǎng)基(shMIF/HHSECs條件培養(yǎng)基、Mock/ HHSECs條件培養(yǎng)基加入p425和基礎(chǔ)培養(yǎng)基)相比,CRC細(xì)胞內(nèi)p-cofilin的表達(dá)顯著增多。然而,在shMIF/HHSECs條件培養(yǎng)基中加入rhMIF后,細(xì)胞內(nèi)p-cofilin的表達(dá)也會(huì)增強(qiáng)。cofilin磷酸化使其失去活性,導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的聚合[12]。如WB和免疫熒光結(jié)果所示,F-actin的表達(dá)在Mock/HHSECs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后明顯增強(qiáng),但用shMIF/HHSECs條件培養(yǎng)基或Mock/HHSECs條件培養(yǎng)基中加上p425培養(yǎng)后,增強(qiáng)的表達(dá)會(huì)被抵消。為了驗(yàn)證外分泌的MIF信號(hào)通路是否會(huì)導(dǎo)致CRC細(xì)胞內(nèi)cofilin磷酸化以及參與調(diào)節(jié)F-action,我們用不同濃度的rhMIF來(lái)刺激CRC細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),50 nM rhMIF會(huì)導(dǎo)致p-cofilin和F-action表達(dá)顯著增加,如果rhMIF濃度超過(guò)50 nM, p-cofilin和F-action的表達(dá)并沒(méi)有進(jìn)一步增加。所以,HHSECs分泌的MIF對(duì)cofilin/F-action的影響特點(diǎn)提示,它可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移。結(jié)論1.結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移靶器官肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是肝內(nèi)趨化結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)的關(guān)鍵細(xì)胞。2.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌的MIF是趨化結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子。3.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌的MIF促進(jìn)肝內(nèi)預(yù)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞的趨化和生長(zhǎng)。4.MIF刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)p-cofilin表達(dá)增多與抑制F-actin解聚有關(guān)。5.結(jié)直腸癌原發(fā)癌MIF的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)關(guān),但與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)相關(guān)。本研究的創(chuàng)新之處1.展現(xiàn)了腫瘤特異性轉(zhuǎn)移器官內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)的旁分泌通路。2.確定HHSECs是趨化預(yù)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的主要誘餌細(xì)胞。3.證明HHSECs分泌的MIF而非腫瘤細(xì)胞自身的MIF在腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用。4. HHSECs以及其旁分泌的MIF有可能成為抗土壤和抗種子治療的共同靶點(diǎn),為對(duì)抗預(yù)轉(zhuǎn)移狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移治療提供理論支持。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞 MIF 旁分泌 趨化 預(yù)轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：