本文關(guān)鍵詞：葛根素對(duì)慢性缺血誘發(fā)的血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的慢性腦灌注不足(CCH)可能導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病或精神疾病,CCH與學(xué)習(xí)和記憶功能障礙密切相關(guān),尤其是血管性癡呆,表現(xiàn)為認(rèn)知障礙和行為不良,CCH動(dòng)物模型可以由中斷兩側(cè)頸動(dòng)脈主干的大鼠制備(稱作2VO大鼠),2VO大鼠腦血流量不足導(dǎo)致大腦皮層、海馬體和白質(zhì)慢性低灌注,從而發(fā)生認(rèn)知功能障礙和不良的新陳代謝,最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,可發(fā)生血管性癡呆。據(jù)報(bào)道稱腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)為內(nèi)環(huán)境平衡的重要調(diào)控系統(tǒng),并被認(rèn)為是治療慢性腦灌注不足CCH誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙的潛在靶點(diǎn)。血管性癡呆主要病因之一是腦血流量減少誘發(fā)的活性氧(ROS)的過(guò)度表達(dá)�；钚匝醯某磉_(dá)作為RAS過(guò)程一部分,可作為氧化應(yīng)激開(kāi)始的標(biāo)志,這被定義為活性氧ROS和與抗氧化反應(yīng)間平衡被打破的標(biāo)志。過(guò)量的ROS和自由基會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷,包括膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用,DNA斷裂及損傷和蛋白質(zhì)損失,在大腦中,活性氧的過(guò)量產(chǎn)生能夠?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡及細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致永久性神經(jīng)損傷。ROS生成和其有害影響不僅在血管性癡呆存在,也見(jiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性、出血性及再灌注條件下的病變。就這一點(diǎn)而言,ROS清除化合物在各種疾病模型中被廣泛測(cè)試以減少活性氧水平。葛根素,一種異黃酮,可以在許多植物和草藥中發(fā)現(xiàn),如葛根的根。葛根素也是常用于治療發(fā)燒和腹瀉的中藥。事實(shí)證明,葛根素具有清除活性氧和減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力。葛根素也被證明在不同種類的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有神經(jīng)保護(hù)作用,如阿爾茨海默氏癥,帕金森氏病和腦缺血。關(guān)于葛根素的保護(hù)作用,其清除活性氧的能力是在大部分的研究中被重點(diǎn)提及的。一些研究還關(guān)注到葛根素在特殊的細(xì)胞類型中具有抗凋亡的活力。然而關(guān)于葛根素對(duì)血管性癡呆的保護(hù)作用目前尚無(wú)此類研究。在本研究中,我們?cè)噲D通過(guò)2 VO大鼠模型驗(yàn)證葛根素對(duì)慢性缺血引起的血管性癡呆具有保護(hù)作用。進(jìn)一步驗(yàn)證葛根素能夠減輕血管性癡呆所致的認(rèn)知和行為障礙。推論葛根素在2 V0大鼠模型中的保護(hù)作用可能是通過(guò)清除ROS以減少氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到的。方法6到8周成年雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,經(jīng)由中斷兩側(cè)頸動(dòng)脈主干制備2VO大鼠模型,給予或不給予葛根素治療。采用莫里斯水迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。丙二醇(MDA),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和總硫醇評(píng)估用于反映腦組織的氧化應(yīng)激。SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)后給予過(guò)氧化氫模擬氧化應(yīng)激,給予或不給予葛根素治療,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8(CCK8)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行檢查細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)及給予不同濃度葛根素治療后的生存率和凋亡率�；钚匝�(ROS)的產(chǎn)生由2’,7’二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)檢驗(yàn)。采用qPCR和Western blot (WB)方法測(cè)試Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4.基因表達(dá)的變化,探討葛根素的分子作用機(jī)制。結(jié)果1、莫里斯水迷宮試驗(yàn)中2VO組動(dòng)物逃脫時(shí)間比假手術(shù)組呈現(xiàn)顯著延遲(P0.05)。在2VO加葛根素干預(yù)組中逃脫時(shí)間較2VO組明顯縮短,改變顯著(P0.05)。假手術(shù)組動(dòng)物給予葛根素干預(yù)后逃脫時(shí)間未見(jiàn)明顯改變。在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間測(cè)試中,2VO模型組在目標(biāo)象限區(qū)域花費(fèi)的平均時(shí)間較短,與假手術(shù)組差異顯著(P0.05)。在2VO加葛根素干預(yù)組在目標(biāo)象限區(qū)域花費(fèi)的平均時(shí)間有所延長(zhǎng),與2VO差異顯著(P0.05)。假手術(shù)組動(dòng)物給予葛根素干預(yù)后在目標(biāo)象限區(qū)域花費(fèi)的平均時(shí)間沒(méi)有任何改變。四組動(dòng)物的游泳速度無(wú)顯著差異。2、在2VO組海馬和額葉皮質(zhì)區(qū)的丙二醛含量較假手術(shù)組明顯提高(P0.05)；葛根素干預(yù)組可以顯著下調(diào)海馬和額葉皮層升高的MDA水平(P0.05)；假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)對(duì)丙二醛含量沒(méi)有任何影響。2VO組的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶濃度較假手術(shù)組較低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；葛根素干預(yù)組顯示了葛根素對(duì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶濃度較大部分修復(fù)作用(P0.05)；假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)與假手術(shù)組比較未顯示任何差異。2VO組的總硫醇濃度較假手術(shù)組顯著減少；葛根素干預(yù)組可以部分提高2V0組減少的總硫醇濃度；假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)與假手術(shù)組比較未顯示任何有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。3、以過(guò)氧化氫作為氧化應(yīng)激物刺激SH-SY5Y細(xì)胞后,給予或不給予葛根素治療均評(píng)估細(xì)胞的存活率。葛根素治療在三個(gè)不同濃度:0.1umol/1,0.5umol/l和1umol/l。分別在12小時(shí),24小時(shí)和48小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果表明,過(guò)氧化氫誘發(fā)的氧化應(yīng)激在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)細(xì)胞的存活率。葛根素治療上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞存活率呈劑量依賴性。1umol/1葛根素治療組改善效果最好,幾乎達(dá)到對(duì)照組的相同水平。然后我們檢測(cè)了氧化應(yīng)激后的細(xì)胞凋亡率,結(jié)果與前相反,葛根素治療降低SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性,1umol/1葛根素治療組改善效果最好,幾乎達(dá)到對(duì)照組相同的水平。4、為了進(jìn)一步探索葛根素對(duì)活性氧的清除能力,我們?cè)赟H-SY5Y細(xì)胞中通過(guò)DCFH-DA測(cè)定做ROS清除能力試驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平通過(guò)DCFH-DA來(lái)分析,因?yàn)镈CFH-DA在細(xì)胞間具有滲透性,且對(duì)氧化敏感。給予氧化氫誘導(dǎo)24小時(shí)后,培養(yǎng)基換做含有不同劑量葛根素的培養(yǎng)基。葛根素治療12小時(shí)或24小時(shí)后,通過(guò)DCFH-DA分析測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。DCF熒光強(qiáng)度的定量分析顯示給予過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的未治療組顯示熒光水平最高。葛根素治療組的ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在12小時(shí)和24小時(shí)均顯著下調(diào)。1 umol/1濃度葛根素組與其他組比較顯示最好的活性氧清除能力(P0.05)。葛根素減少SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)DCF熒光存在明顯劑量依賴性。5、我們通過(guò)qPCR和免疫印跡進(jìn)行測(cè)試Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4基因表達(dá)的變化。結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn),雖然葛根素治療組可以顯著提高Nrf2 mRNA的表達(dá),但過(guò)氧化氫對(duì)Nrf2的mRNA水平并沒(méi)有影響。至于FoxO家族,通過(guò)氧化氫誘導(dǎo)FoxO1 FoxO3 FoxO4提高了在mRNA水平表達(dá)。葛根素治療增強(qiáng)了過(guò)氧化氫的FoxO1 FoxO3 FoxO4在mRNA水平表達(dá)增高的效應(yīng)(P0.05)。這個(gè)結(jié)果與通過(guò)WB檢測(cè)的蛋白水平的結(jié)果是一致的。WB圖像的定量分析顯示,這些抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá)是根據(jù)mRNA水平改變情況以不同的模式被上調(diào)的。結(jié)論1、我們的研究結(jié)果表明,無(wú)論是體內(nèi)環(huán)境慢性缺血誘發(fā)的還是體外過(guò)氧化氫誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng),葛根素干預(yù)后均可以有明顯逆轉(zhuǎn)作用。對(duì)于2V0老鼠,葛根素干預(yù)也會(huì)提高學(xué)習(xí)能力和鞏固記憶,我們發(fā)現(xiàn)葛根素的保護(hù)作用都與葛根素對(duì)ROS的清除能力密切相關(guān),無(wú)論是慢性缺血誘發(fā)的還是體外過(guò)氧化氫誘發(fā)的反應(yīng),此現(xiàn)象也能解釋葛根素體外試驗(yàn)的抗凋亡活力。在分子水平,我們發(fā)現(xiàn)葛根素的治療作用與幾種抗氧化蛋白表達(dá)相關(guān),mRNA水平, Nrf2、FoxO1 Fox03和Fox04蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)。還有一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn),過(guò)氧化氫處理也可以上調(diào)Nrf2的表達(dá)。2、我們的研究中2V0老鼠被選為體內(nèi)動(dòng)物模型,雙側(cè)的頸總動(dòng)脈結(jié)扎可能導(dǎo)致大腦全球缺血。兩個(gè)目標(biāo)區(qū)域,即海馬和額葉皮質(zhì),幾乎全部受到這個(gè)缺血影響,其中海馬負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶功能。然后我們使用莫里斯水迷宮測(cè)試每組的學(xué)習(xí)和記憶功能。所有結(jié)果表明葛根素對(duì)2V0老鼠受損的學(xué)習(xí)和記憶能力具有保護(hù)作用。3、已經(jīng)證實(shí)氧化應(yīng)激在缺血和缺氧性腦損傷中扮演著關(guān)鍵角色。氧化應(yīng)激也與炎性細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)和血管受損導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙相關(guān)�；钚匝跄軌蜓趸ぶ|(zhì),細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的核酸,最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙�？紤]到這個(gè),我們重點(diǎn)關(guān)注2V0大鼠腦組織中ROS的過(guò)度生成和自由基的產(chǎn)生,我們測(cè)量了MDA的水平,這是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一個(gè)標(biāo)志。谷胱甘肽過(guò)氧化酶和硫醇含量分別測(cè)量體外試驗(yàn)中對(duì)抗活性氧生成的酶促和非酶促性防御反應(yīng)。為了進(jìn)一步解釋葛根素在體外試驗(yàn)中對(duì)ROS的清除能力,選取SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),給予過(guò)氧化氫作為刺激物施加刺激,模擬體內(nèi)狀態(tài)時(shí)缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。我們的結(jié)果指出葛根素治療能夠減少過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)葛根素治療部分逆轉(zhuǎn)了過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的不利影響,呈計(jì)量依賴性。4、為了探索其潛在機(jī)制,我們重點(diǎn)關(guān)注調(diào)控因子FOX O家族(FoxO)和Nrf2的表達(dá)。FoxO家族通過(guò)提高幾種抗氧化酶的氧化還原信號(hào)的表達(dá)以減少ROS生成。FoxO家族蛋白質(zhì)也是調(diào)控細(xì)胞增殖,分化,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期逮捕和自噬的轉(zhuǎn)錄因子。另一個(gè)我們關(guān)注Nrf2基因,也調(diào)節(jié)對(duì)氧化損害有保護(hù)作用的抗氧化蛋白質(zhì)。FoxO家族和Nrf2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生理功能和病理作用。我們首次報(bào)道了葛根素治療作用與上調(diào)缺血大腦中的這些基因具有相關(guān)性�？傊�,我們猜測(cè)葛根素對(duì)慢性腦缺血誘發(fā)的血管性癡呆具有保護(hù)作用表現(xiàn)在減輕氧化應(yīng)激和提高認(rèn)知能力。
【關(guān)鍵詞】：血管性癡呆 葛根素 氧化應(yīng)激 活性氧 認(rèn)知功能障礙 細(xì)胞凋亡 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)綜述20-33
• 材料與方法33-43
• 結(jié)果43-48
• 討論48-52
• 結(jié)論52-53
• 附表53-59
• 附圖59-73
• 參考文獻(xiàn)73-82
• 致謝82-83
• 攻讀學(xué)位期間學(xué)術(shù)成果83-84
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表84-85
• 外文論文185-99
• 外文論文299-103

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase, p53 and Bcl-2 in Gastric Precancerous and Cancerous Lesions: Correlation with Clinical Features[J];Chinese Journal of Clinical Oncology;2006年05期

  本文關(guān)鍵詞：葛根素對(duì)慢性缺血誘發(fā)的血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：255916