【摘要】：研究背景慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)與鼻息肉(Nasal polyps,NPs)的發(fā)生密切相關(guān),大約有20%的CRS患者同時伴有鼻息肉。大多數(shù)的NPs患者的上皮出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能異常,包括上皮增生和鱗狀上皮化生,黏膜的慢性炎癥和異常上皮組織重塑是其主要的組織學(xué)特征。由于NPs復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和較高的復(fù)發(fā)率,耳鼻喉科醫(yī)師對其診斷和治療面臨著極大的挑戰(zhàn)。相關(guān)研究表明,NPs的發(fā)生發(fā)展過程中上皮改變起到十分重要的作用。然而,由于缺乏鼻上皮干細(xì)胞特性的關(guān)鍵信息,仍然很難區(qū)別鼻腔上皮正常和異常修復(fù)的潛在機(jī)制。有研究表明鼻腔上皮中的基底細(xì)胞具有干/祖細(xì)胞的特性并在上皮修復(fù)方面起到重要作用。因此,通過體外培養(yǎng)及比較來自正常鼻腔黏膜和鼻息肉組織的鼻上皮干細(xì)胞有助于我們從一個不同的,更特殊的方面闡明鼻腔疾病的病理生理過程。多年來Ki67細(xì)胞核抗體做為評價細(xì)胞增殖能力的預(yù)測標(biāo)記物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。Ki67在所有活動的細(xì)胞周期都出現(xiàn)表達(dá)(G1期,S期,G2期和M期),但是在靜止期不表達(dá)(G0期)。Ki67表達(dá)的增加與腫瘤的惡性程度有關(guān),與組織的炎癥程度相關(guān)(例如,哮喘,膽脂瘤)。既往研究顯示,鼻息肉患者重塑上皮中Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量,與正常對照組相比出現(xiàn)明顯增加。到目前為止,大多數(shù)的研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemical,IHC)方法分析Ki67抗體抗人Ki67蛋白(pKi67)的陽性表達(dá)水平。但是,較少的研究關(guān)注Ki67蛋白的分布情況(如,結(jié)構(gòu)和位置),而這些方面可能對Ki67蛋白功能的研究更有意義。按照人Ki67蛋白(pKi67)在細(xì)胞周期的不同階段,在培養(yǎng)的MCF7細(xì)胞中可以分成三種亞型:1)離散的顆粒分布在細(xì)胞核漿(早期G1);2)聚集的顆粒局限在核仁(S期到G2期);3)聚集物分布于染色體周邊(M期)。本研究的目的就是通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探討鼻息肉上皮(增生的上皮和鱗狀化生的上皮)以及正常鼻黏膜上皮中基底細(xì)胞類型以及基底細(xì)胞中Ki67蛋白的表達(dá)和分布類型。這些結(jié)果將同時與細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記物的mRNA水平進(jìn)行比較。希望本研究結(jié)果能夠?yàn)楸窍⑷庵厮苌掀撛诘姆肿訖C(jī)制提供新的見解。實(shí)驗(yàn)方法1、構(gòu)建人上鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)體外模型。將來源于鼻息肉黏膜和對照組下鼻甲黏膜經(jīng)過酶消化后得到的分離細(xì)胞(原代細(xì)胞,P0)種植于準(zhǔn)備好的NIH/3T3上,以2× 103細(xì)胞數(shù)/cm2的密度接種于24孔板在無血清培養(yǎng)基中生長。我們在hNESPCs細(xì)胞覆蓋達(dá)80%的密度,使用酶消化的方法進(jìn)行傳代。每個樣本在每一代通過計算克隆形成率和細(xì)胞倍增時間,來研究hNESPCs細(xì)胞的生長和增殖能力。hNESPCs細(xì)胞在氣-液界面(Air-liquid interface,ALI)進(jìn)行分化培養(yǎng),通過免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色(IF)和纖毛擺動頻率(CBF)測定進(jìn)一步分析hNESPCs的分化能力并觀察分化過程。2.Ki67蛋白在hNESPCs體外模型中表達(dá)及分布的研究。原代細(xì)胞種植后48小時或P1細(xì)胞(P2、P3)傳代72小時后,福爾馬林固定細(xì)胞用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色,同時在這個時刻收集細(xì)胞的RNA用于進(jìn)一步研究。我們采用倒置相差顯微鏡,每個樣本選擇三個視野(×400倍)觀察并計數(shù)p63+細(xì)胞、K67+細(xì)胞以及p63+/Ki67+雙重陽性細(xì)胞,觀察分析Ki67陽性細(xì)胞的三種亞型并拍照。采用RT-PCR方法研究Ki67蛋白及細(xì)胞周期標(biāo)記物mRNA水平在hNESPCs細(xì)胞傳代過程中表達(dá)及分布情況。運(yùn)用Mann-Whitney檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3.Ki67蛋白在鼻上皮細(xì)胞中表達(dá)及分布的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。樣本來自55例鼻息肉患者和18例正常對照組(下鼻甲)。其中15例鼻息肉患者經(jīng)過3周糖皮質(zhì)激素治療,并在治療前后分別取其息肉樣本。部分組織固定于福爾馬林溶液中進(jìn)行IHC和IF染色用于組織學(xué)評估。另一部分組織采用RT-PCR方法進(jìn)行mRNA水平檢測。分類變量的組間不同的比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。運(yùn)用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析鼻息肉組和正常對照組之間Ki67、p63陽性細(xì)胞數(shù)目、Ki67亞型的百分比、Ki67以及細(xì)胞周期標(biāo)記物mRNA水平的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.我們的研究證實(shí)可以從人鼻黏膜組織中分離和培養(yǎng)hNESPCs,并在至少前四代中能維持他們自我更新和分化的潛能。hNESPCs細(xì)胞可以成功的在氣液界面上(ALI)分化成分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞,與呼吸道的假復(fù)層上皮非常相似。鼠纖維細(xì)胞NIH/3T3可以用作hNESPCs在無血清培養(yǎng)條件下的飼養(yǎng)層。這有助于建立體外篩查和驗(yàn)證人鼻腔上皮細(xì)胞活性及其對治療反應(yīng)的體外模型。2.Ki67蛋白在hNESPCs體外模型中表達(dá)及分布的研究。在鼻息肉和下鼻甲黏膜來源hNESPCs細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 Ki67蛋白三種亞型。下鼻甲來源的hNESPCs在體外傳三代(P1,P2,P3)的過程中,Ⅰ型Ki67細(xì)胞占總體Ki67陽性細(xì)胞百分比分別為(18.0%,18.4%,18.6%),Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比分別為(82.0%,81.6%,81.4%)。然而,Ⅰ型Ki67細(xì)胞百分比在鼻息肉來源hNESPCs細(xì)胞傳代過程中逐漸從20.0%,29.58%上升到40.0%而且Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比在細(xì)胞傳代過程中逐漸從80.0%,70.14%下降到60.0%。此外,在P3代細(xì)胞中,Ⅰ型Ki67細(xì)胞百分比(p=0.04)與Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比(p=0.04)在鼻息肉來源的hNESPCs與正常鼻黏膜來源的hNESPCs之間的差異達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅲ型Ki67細(xì)胞在鼻息肉和正常鼻黏膜來源的hNESPCs體外傳代過程(P1-P3)中幾乎沒有觀察到。G1期相關(guān)的細(xì)胞周期標(biāo)記物(CCND1、CDK4和CDK6)以及促進(jìn)S期進(jìn)入有絲分裂期(M期)的細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記物(CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1)在鼻息肉患者中表達(dá)量與對照組相比出現(xiàn)了顯著下降。M期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(CDK1、CCNA2和CCNB1)的mRNA表達(dá)水平在鼻息肉上皮的傳代過程中與正常組相比差異沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。3.Ki67蛋白在鼻上皮細(xì)胞中表達(dá)及分布的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。與對照組相比,p63陽性細(xì)胞數(shù)目在鼻息肉增生上皮(1.53倍,p0.0001)和鱗狀上皮化生上皮(2.02倍,p0.0001)明顯增加。增生的基底細(xì)胞有三種類型(p63+/Ki67+)并出現(xiàn)在細(xì)胞周期的不同階段,例如G1期(Ⅰ型細(xì)胞),S期到G2期(Ⅱ型細(xì)胞)以及有絲分裂期(Ⅲ型細(xì)胞)。最重要意義的是,一些Ⅰ細(xì)胞增殖后可能會進(jìn)入靜止期,雖然這些細(xì)胞仍然是p63+/Ki67+陽性細(xì)胞。Ⅰ型細(xì)胞與Ⅱ型細(xì)胞在正常鼻上皮中的比值是50:50。然而,鼻息肉增生上皮和鱗狀上皮化生上皮中,Ⅰ型細(xì)胞的百分比與對照組相比,分別上升到63.03%和64.26%,Ⅱ型細(xì)胞的百分比分別降低到34.85%和30.77%,另外Ⅲ型細(xì)胞在鼻息肉鱗狀化生的上皮中百分比是3.45%。G1期相關(guān)的細(xì)胞周期標(biāo)記物(CCND1、CDK4和CDK6)和促進(jìn)S期進(jìn)入有絲分裂期(M期)的細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記物(CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1)在鼻息肉患者中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常對照組的表達(dá)量。M期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(CDK1、CCNA2和CCNB1)在鼻息肉鱗狀化生上皮的mRNA表達(dá)水平要明顯超過鼻息肉增生上皮的表達(dá)量。IF結(jié)果顯示鼻息肉患者經(jīng)過GC治療后Ki67陽性細(xì)胞數(shù)目6.0(4.0-8.0)與治療前的數(shù)目13.0(8.0-16.0)相比出現(xiàn)了明顯下降(p0.05)。然而,鼻息肉患者的Ⅰ型Ki67細(xì)胞百分比和Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比之間的不平衡在經(jīng)過3周GC治療后并沒有改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)論總之,我們的研究成功的從人鼻黏膜組織中分離和培養(yǎng)hNESPCs細(xì)胞,并在至少前四代中能維持他們自我更新和分化的潛能。本研究首次表明Ki67細(xì)胞三種類型在鼻息肉重塑上皮的基底細(xì)胞中的異常表達(dá)和分布,以及其與細(xì)胞周期階段的關(guān)系,這種異常表達(dá)和分布在用糖皮質(zhì)激素治療3周后并沒有出現(xiàn)改善。由于細(xì)胞周期是動態(tài)的過程,闡明Ki67陽性細(xì)胞位置的細(xì)節(jié)特征及其與細(xì)胞周期的關(guān)系,能為這個廣泛應(yīng)用的標(biāo)記物在鼻息肉上皮中研究提供的新視野。
【圖文】：

．邋ｈＮＥＳＰＣｓ細(xì)胞的生長和增殖能力。（Ａ）根據(jù)克隆形成前３天每個克目計算倍增時間（Ｘ２００倍；標(biāo)尺＝５０邋＾ｍｌ）。腳克隆形成７２ｈ后計算（亮藍(lán)染色，ｘｌＯＯ倍；標(biāo)尺＝１００＾０１）。逡逑Ｐ６３／ＫＲＴ５／ＤＡＰＩ邐ｐ６３邋化邋ｉ６７／ＤＡＩＭ邋ｐｉＶ－ｌｕｈｕｌｉｉｉ邋瓜邋ＡＮ邋ＭＵＣ５ＡＣ７ＤＡＰ１逡逑國■Ｂ邐Ｐ６．ＶＤＡＰＩ邐Ｋｉ６７／ＤＡＰＩ邐ｐｉＶ－ｌｕｈｕｌｉｎ／ＤＡＰＩ邋ＭＤＣ５ＡＣ７ＤＡＰＩ逡逑國國■

圖６．邋ｈＮＥＳＰＣｓ細(xì)胞分化形成的纖毛細(xì)胞。３Ｄ共聚焦重建ｈＮＥＳＰＣｓ細(xì)胞分化形逡逑成纖毛簇的代表圖像。大約２０％－４０％的細(xì)胞在矢狀面（Ａ）和頂面圖（Ｂ）是逡逑ｐｌＶ－ｔｕｂｕｌｉｎ纖毛細(xì)胞（綠色）染色陽性（ＤＡＰＩ染細(xì)胞核，藍(lán)色）。ｈＮＥＳＰＣｓ細(xì)胞逡逑分化的單個纖毛細(xì)胞（Ｃ）和來自鼻刷的原代纖毛細(xì)胞（Ｄ）的形態(tài)相似（Ｘ６００倍）。逡逑表１．邋ｈＮＥＳＰＣｓ細(xì)胞k我淮謀對鍪奔浜涂寺⌒緯陜叔義洗偽禭検奔洌ǎ瑁╁危茫疲牛ǎ矗埃埃案魷赴梗╁義希校板危保福矗保玻保村危保玻板澹澹埃埃沖義希校卞危玻矗罰叮保擔(dān)稿危梗常板澹澹埃擔(dān)板義希校插危玻矗埃插澹澹玻埃稿危罰擔(dān)板澹澹埃擔(dān)村義希校沖澹常玻常靛澹澹叮埃插危矗梗板澹澹埃叮村五義，

本文編號：2524629