【摘要】：背景類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性進(jìn)行性對(duì)稱(chēng)性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚不明確。RA的主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的滑膜炎、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成,骨破壞是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥,常累及軟骨及骨質(zhì),導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,甚至關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞而引起畸形、功能障礙,從而增加了 RA致殘率,其危害性非常嚴(yán)重。因此,延緩甚至阻斷骨破壞已成為治療RA的主要策略之一。大量研究認(rèn)為,RA的慢性炎癥是導(dǎo)致其骨破壞的主要因素,但臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)RA患者即使在炎癥得到控制、病情完全緩解的情況下,部分RA患者在疾病后期仍出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞,即存在所謂的"炎癥與骨破壞分離"現(xiàn)象。在應(yīng)用抗風(fēng)濕藥控制RA病情活動(dòng)的同時(shí),骨破壞依然存在,此外,雖有生物制劑能延緩骨破壞的報(bào)道,卻難以完全阻止骨破壞的進(jìn)展。因此,RA骨破壞的發(fā)生機(jī)制及治療方法有待于進(jìn)一步研究,以期能夠抑制RA骨破壞的發(fā)生發(fā)展。鐵調(diào)素(Hepcdin,Hepc)是一種在鐵代謝中起著重要作用的小分子多肽,其表達(dá)受多種因素影響,如血清鐵水平、促紅細(xì)胞生成素、低氧和氧化應(yīng)激等,在機(jī)體鐵代謝平衡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Hepc水平還受炎癥的調(diào)節(jié),炎癥可以刺激Hepc的生成,在RA患者中血清Hepc水平異常升高,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),鐵調(diào)素能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化,上調(diào)破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、CTK和MMP-9的表達(dá)。因此推測(cè)鐵調(diào)素可能參與了 RA骨破壞的發(fā)生。RA屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)"痹證"的范疇,主要病機(jī)為"肝腎虧虛、風(fēng)濕瘀阻",其骨質(zhì)破壞是由于外邪內(nèi)侵,風(fēng)濕相搏,病久肝腎虧虛,筋脈失養(yǎng),邪入脈絡(luò),痰瘀交阻,侵害筋骨,以致關(guān)節(jié)變形,出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。斷藤益母湯是針對(duì)此病機(jī)而確立,具有"補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)"的功效,可有效控制RA疾病活動(dòng),但尚未對(duì)本方對(duì)RA骨代謝的影響進(jìn)行臨床觀察。本研究來(lái)源于廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014A030313403),擬通過(guò)臨床研究,觀察RA患者的骨代謝情況及Hepc的表達(dá)情況,及Hepc與骨代謝的相關(guān)性;評(píng)估斷藤益母湯對(duì)RA患者臨床血清骨代謝指標(biāo)的影響;通過(guò)建立CIA大鼠模型,探討斷藤益母湯對(duì)RA骨破壞的影響及其作用機(jī)制。一、臨床研究目的:觀察斷藤益母湯對(duì)RA骨破壞的臨床療效及安全性,通過(guò)對(duì)Hepc的水平進(jìn)行檢測(cè),分析其與骨代謝的相關(guān)性,進(jìn)行斷藤益母湯治療RA骨破壞的機(jī)制探討。方法:納入74例RA患者及20例健康志愿者,將74例RA患者隨機(jī)分為對(duì)照組37例、試驗(yàn)組37例。對(duì)照組予甲氨蝶呤片治療,試驗(yàn)組予斷藤益母湯治療。檢測(cè)并比較RA患者與健康志愿者的血清鐵調(diào)素(Hepc)、I型膠原羧基末端肽(β-CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)水平。于治療后復(fù)查兩組RA患者的血清Hepc及骨代謝指標(biāo),并進(jìn)行相關(guān)性分析,計(jì)算DAS28情況進(jìn)行病情活動(dòng)評(píng)價(jià),分別在基線期及治療第4、8、12周記錄兩組患者的TJC、SJC、PGA、MDGA、ESR、CRP、SDAI評(píng)分等疾病活動(dòng)指標(biāo)及安全性指標(biāo),并觀察不良反應(yīng)方發(fā)生情況、記錄合并用藥情況,療程均為12周。結(jié)果:RA患者的血清Hepc、β-CTX、TRAP5b水平均較健康組升高,血清BALP水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。治療后,試驗(yàn)組DAS28有效率優(yōu)于對(duì)照組,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。兩組患者治療后,TJC、SJC、PGA、MDGA評(píng)分均較治療前改善,對(duì)照組在第8周四項(xiàng)指標(biāo)開(kāi)始改善(P0.01),至第12周得到進(jìn)一步改善(P0.01)。試驗(yàn)組從治療后第4周開(kāi)始改善(P0.01),第8、12周得到進(jìn)一步改善(P0.01)。兩組TJC、PGA、MDGA比較,第4、8、12周時(shí)試驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P0.01);兩組SJC比較,第4、8周時(shí)試驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P0.01),但至第12周,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。兩組疾病活動(dòng)指標(biāo)均較治療前得到明顯改善(P0.01),治療第4周試驗(yàn)組CRP、ESR、SDAI評(píng)分均開(kāi)始改善(P0.01或P0.05),第8、12周得到進(jìn)一步改善(P0.01);對(duì)照組至第4周SDAI評(píng)分均開(kāi)始改善,第8周CRP、ESR指標(biāo)開(kāi)始改善(P0.01或P0.05),兩組CRP比較,第8周時(shí)試驗(yàn)組顯著優(yōu)于對(duì)照組(P0.01),但至第12周,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);治療12周后,試驗(yàn)組ESR、SDAI評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組(P0.05)。治療12周后,兩組患者Hepc、β-CTX、TRAP5b均降低(P0.01),且試驗(yàn)組Hepc、β-CTX、TRAP5b水平優(yōu)于對(duì)照組(P0.01或P0.05),兩組治療前后BALP比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。治療前,RA血清Hepc水平與β-CTX、TRAP5b、BALP、ESR、CRP、SDAI均存在明顯正相關(guān)(P0.01,P0.05);治療后,RA血清Hepc水平與β-CTX、TRAP5b、ESR、CRP、SDAI均存在明顯正相關(guān)(P0.01),但與BALP無(wú)相關(guān)性(P0.05)。安全性分析提示,治療后,兩組患者WBC、PLT降低,RBC、HGB升高,其中兩組WBC及對(duì)照組PLT、RBC、HGB水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而試驗(yàn)組中RBC、HGB升高,PLT降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)照組中1例出現(xiàn)肝功能損害,試驗(yàn)組中4例女性患者出現(xiàn)月經(jīng)量少。結(jié)論:1.RA患者中Hepc水平升高,與骨吸收指標(biāo)存在明顯相關(guān)性。2.斷藤益母湯能夠在控制RA疾病活動(dòng)的同時(shí),有效改善RA骨代謝水平,抑制骨破壞,其機(jī)制可能與抑制血清Hepc表達(dá)有關(guān)。二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察CIA大鼠中Hepc的表達(dá)情況及其與骨代謝的關(guān)系,評(píng)估斷藤益母湯對(duì)RA骨破壞的治療作用,并探討其作用機(jī)制。方法:選取65只Wistar.雄性大鼠,隨機(jī)取60只大鼠用于模型復(fù)制,其余5只大鼠作為空白對(duì)照組。造模成功后,將造模組隨機(jī)分為6組:正常組(Control)、模型組(Model)、AG490組、甲氨蝶呤組(MTX)、斷藤益母湯低劑量組(DTL)、斷藤益母湯中劑量組(DTM)、斷藤益母湯高劑量組(DTH)。各用藥組均連續(xù)給藥6周,在造模及用藥期間觀察大鼠的一般情況,每周進(jìn)行體重測(cè)量及大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index AI)評(píng)估。末次給藥24h后,腹主動(dòng)脈取血,進(jìn)行血清Hepc、TRAP-5b、CTX-1檢測(cè)。取左側(cè)股骨用生理鹽水浸透的紗布包裹,用作Micro-CT檢測(cè)。取右側(cè)股骨,用4%多聚甲醛固定,用于HE染色。分離雙側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織,進(jìn)行RT PCR及Western blot 檢測(cè),觀察 JAK/STAT 通路中 JAK2、STAT3 的 mmRNA 水平及 p-JAK2、p-STAT3 蛋白水平的變化。應(yīng)用STATA11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.Wistar大鼠CIA造模成功率為56.7%。在初次免疫14-18天大鼠足部及踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎表現(xiàn),于初次免疫后第4-5周天左右達(dá)高峰,隨后腫脹逐漸減輕,少數(shù)出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直,活動(dòng)受限,與RA病理過(guò)程相似,提示造模成功。2.與Control組比較,Model組大鼠體重減輕,AI評(píng)分加重,骨顯微結(jié)構(gòu)受損,骨吸收指標(biāo)及血清Hepc水平升高,且二者存在正相關(guān)(Hepc與TRACP-5b的相關(guān)性:r=0.6483,PO.0l;Hepc 與 CTX-1 的相關(guān)性:r=0.7149,PO.01)。符合本研究所需的研究模型,以進(jìn)行進(jìn)一步的藥效及機(jī)制研究。3.給予斷藤益母湯干預(yù)后,大鼠體重增加(P0.05),關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分減低(P0.05),股骨HE染色及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)改善(P0.05),骨吸收指標(biāo)下降(P0.05),呈劑量依賴(lài)性,DTH組療效優(yōu)于MTX組。4.斷藤益母湯治療后,大鼠血清Hepc下降(P0.05),呈劑量依賴(lài)性。5.CIA大鼠炎癥發(fā)病過(guò)程中,JAK/STAT信號(hào)通路處于激活狀態(tài),JAK2、STAT3的mRNA及P-JAK2、P-STAT3的蛋白表達(dá)水平升高,以P-JAK2的蛋白表達(dá)上調(diào)明顯。6.給予大鼠進(jìn)行AG490干預(yù)后,可明顯抑制JAK2基因及蛋白表達(dá)(P0.05),JAK2下游STAT3分子的mRNA及蛋白磷酸化明顯受抑制(P0.05),血清Hepc水平明顯下降(P0.05),股骨HE染色及股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)明顯改善(P0.05),骨吸收指標(biāo)下降(P0.05)。7.斷藤益母湯能夠抑制JAK/STAT信號(hào)通路,下調(diào)JAK2、STAT3的mRNA及p-JAK2、P-STAT3的蛋白表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論:1.在RA炎癥過(guò)程中,骨吸收指標(biāo)及Hepc的表達(dá)水平升高,并且二者存在明顯的正相關(guān)。2.斷藤益母湯可有效改善RA病情、抑制RA骨破壞,其作用呈劑量依賴(lài)性。3.RA發(fā)病過(guò)程中可能通過(guò)激活JAK/STAT信號(hào)通路,上調(diào)了鐵調(diào)素的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及功能,參與RA骨破壞發(fā)病過(guò)程。4.斷藤益母湯可能通過(guò)抑制JAK/STAT通路的相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá),下調(diào)鐵調(diào)素的表達(dá),進(jìn)而起到骨保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【參考文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
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