【摘要】：背景:我國是胃癌高發(fā)國家,胃癌發(fā)病率和致死率均位居我國腫瘤發(fā)病和死亡率前列,血管生成擬態(tài)是近年來新發(fā)現(xiàn)的血管生成形式,與胃癌的不良預后密切相關,而乏氧微環(huán)境是促進腫瘤血管生成擬態(tài)形成的主要因素之一,且與瘀毒互結(jié)證關系密切�？拱┟轿鼽S丸具有活血解毒功效并對多種腫瘤具有抑制作用,我們推測,具有解毒活血功效的西黃丸抑制腫瘤的可能機制是通過調(diào)控乏氧微環(huán)境進而抑制腫瘤血管生成擬態(tài)來實現(xiàn)的。目的:明確西黃丸調(diào)控乏氧微環(huán)境進而抑制腫瘤血管生成擬態(tài)形成的相關機制,探索西黃丸抗腫瘤的內(nèi)在靶標,豐富活血解毒法治療腫瘤的內(nèi)涵。方法:(1)實驗分組:空白組、西黃丸組、HIF-1α抑制劑(2-ME)組、結(jié)合組;(2)體外采用人胃癌MGC-803細胞系,CCK-8法檢測西黃丸對腫瘤細胞增殖的抑制作用,AV-PI法檢測西黃丸對腫瘤細胞凋亡的影響,RNA酶法檢測西黃丸對腫瘤細胞周期的影響,體內(nèi)實驗采用Balb/c裸鼠建立MGC-803移植瘤模型,觀察和測量西黃丸對裸鼠移植瘤腫瘤體積和質(zhì)量的影響;(3)使用低氧工作站建立乏氧細胞培養(yǎng)模型、通過三維培養(yǎng)建立體外腫瘤細胞擬態(tài)血管模型,體外實驗通過顯微鏡下管道計數(shù)、體內(nèi)實驗通過PAS-CD31免疫化學-免疫組化雙染色法計算各組管道形成數(shù)目。(4)體內(nèi)實驗采用 RT-qPCR、Western-blot,體外實驗采用 RT-qPCR、Western-blot、IHC法檢測血管生成擬態(tài)相關蛋白VE-Cadherin、EphA2、MMP-2蛋白及mRNA表達、p-EphA2蛋白表達、HIF-1α、Twist1蛋白及mRNA表達情況。(5)HTA2.0芯片篩選西黃丸抗腫瘤和調(diào)控乏氧通路相關基因,并進行RT-qPCR驗證。結(jié)果:(1)西黃丸可以抑制MGC-803細胞增殖,并呈濃度和時間依賴性,IC50:24h為50.424μg/ml,48h為35.129μg/ml,72h為28.191μg/ml,并抑制裸鼠移植瘤腫瘤的生長。同時,西黃丸可以促進MGC-803細胞凋亡,并將其細胞周期阻滯在G0/G1期。(2)建立體外和體內(nèi)MGC-803細胞擬態(tài)管道形成模型,西黃丸可以顯著抑制體外乏氧條件下和體內(nèi)MGC-803擬態(tài)管道的形成,與2-ME的抑制作用相近,結(jié)合組對擬態(tài)管道形成的抑制作用最強。(3)西黃丸、2-ME、結(jié)合組可以降低體內(nèi)和體外VE-Cadherin、MMP-2的mRNA表達,可以降低體內(nèi)和體外VE-Cadherin、MMP-2的蛋白表達及p-EphA2的表達,結(jié)合組可以更顯著的降低如上蛋白的mRNA和蛋白的表達。結(jié)合組可以降低EphA2的mRNA的表達,但不能顯著影響其蛋白的表達;西黃丸、2-ME、結(jié)合組對EphA2蛋白和mRNA的表達沒有顯著影響。西黃丸、2-ME、結(jié)合組可以降低體外HIF-1α的mRNA和蛋白表達,降低Twist1的mRNA表達;在體內(nèi)降低HIF-1α和Twist1的mRNA及蛋白表達。(4)HTA2.0基因芯片篩選西黃丸可能的作用通路靶點,發(fā)現(xiàn)西黃丸可以顯著下調(diào)628個基因表達,上調(diào)88個基因表達。顯著下調(diào)9個lncRNA表達,上調(diào)11個lncRNA表達,并對54條信號通路具有顯著影響。結(jié)合前述研究結(jié)果選取乏氧信號通路和細胞周期信號通路進行驗證,發(fā)現(xiàn)西黃丸可以降低HIF-1α上有蛋白mTOR表達,促進翻譯后修飾蛋白PHD2、VHL蛋白基因表達,降低細胞周期相關蛋白(SMC3、CDC25c、CDC6、MCM3)基因的表達水平。結(jié)論:西黃丸可以通過(1)抑制乏氧相關mTOR-HIF-1α-Twistl信號通路,(2)促進乏氧相關蛋白PHD2、VHL表達,(3)抑制血管生成擬態(tài)相關蛋白VE-Cadherin、MMP-2表達及EphA2蛋白磷酸化,(4)抑制SMC3、CDC25c、CDC6、MCM3等細胞周期相關基因表達從而抑制人胃癌MGC-803細胞增殖及血管生成擬態(tài)形成的。
[Abstract]:BACKGROUND: China is a high incidence of gastric cancer. The morbidity and mortality of gastric cancer are in the forefront of the incidence and mortality of the tumor in China. The formation of angiogenesis is the newly discovered form of angiogenesis in recent years. It is closely related to the poor prognosis of gastric cancer. The hypoxic micro-environment is one of the main factors to promote the formation of tumor angiogenesis, and has a close relationship with the syndrome of blood stasis and poison. The anti-cancer Nifang pill has the effects of promoting blood circulation and removing toxic materials and inhibiting various tumors, and we have speculated that the possible mechanism of the western yellow pill with the effects of removing toxic substance and promoting blood circulation can be realized by regulating the hypoxic microenvironment and further inhibiting the formation of the tumor blood vessel. Objective: To study the mechanism of XHuangwan to regulate the hypoxic microenvironment and to inhibit the formation of tumor angiogenesis, and to explore the internal target of the anti-tumor of Xihuang Wan and enrich the connotation of the blood-activating and detoxicating method in the treatment of the tumor. Methods: (1) Experimental group: blank group, Xihuang pill group, HIF-1 inhibitor (2-ME) group and combination group; (2) human gastric cancer MGC-803 cell line and CCK-8 method were used in vitro to detect the inhibition of the proliferation of the tumor cells, and the AV-PI method was used to detect the effect of Xhuang pill on the apoptosis of the tumor cells. The effect of sihuang pill on the cell cycle of the tumor was detected by RNA enzyme method. In vivo, the tumor model of MGC-803 was established by Balb/ c nude mice, and the effect of Xihuang pill on the tumor volume and quality of the transplanted tumor in nude mice was observed and measured. (3) The hypoxic cell culture model was established by using the hypoxia workstation. The model of the in vitro tumor cell model was established by three-dimensional culture, and the number of tubes in each group was calculated by using a PAS-CD31 immunochemical-immunohistochemical double-staining method in vitro. (4) RT-qPCR, Western-blot and IHC were used to detect the expression of VE-Cadherin, EphA2, MMP-2 and the expression of mRNA, p-EphA2 protein, HIF-1, Twin1 and mRNA in the blood vessels by RT-qPCR, Western-blot and IHC. And (5) screening the anti-tumor and regulating the related genes of the hypoxia pathway by using the HTA2.0 chip, and carrying out RT-qPCR verification. Results: (1) Xihuang Wan can inhibit the proliferation of MGC-803 cells, and show the concentration and time-dependence, IC50:24 h is 50.424. mu. g/ ml,48 h is 35.129.mu. g/ ml, 72h is 28.191. mu. g/ ml, and the growth of transplanted tumor in nude mice is inhibited. At the same time, it can promote the apoptosis of MGC-803 cells and block the cell cycle in G0/ G1 phase. (2) In vitro and in vivo MGC-803 cell-like tube formation model, Xihuang pill can significantly inhibit the formation of the in vitro hypoxia condition and the in-vivo MGC-803 pseudo-state pipeline, which is similar to that of 2-ME, and the combination group has the strongest inhibition effect on the formation of the quasi-state pipeline. (3) The expression of VE-Cadherin, MMP-2 and the expression of p-EphA2 in the in-vivo and in-vitro VE-Cadherin and MMP-2 can be reduced and the expression of p-EphA2 can be reduced in vivo and in vitro. The binding group could decrease the expression of EphA2 mRNA, but could not significantly affect the expression of its protein. The expression of HIF-1 and Twin1 mRNA and protein in the in vitro expression of HIF-1 and Twin1 were decreased in Xhuang Pills,2-ME and combination group. (4) The gene chip of HTA2.0 was used to screen the possible pathway target of XHuangwan, and it was found that the expression of 628 genes could be reduced significantly and the expression of 88 genes was up-regulated. Significant down-regulation of 9 lncRNA expression, up-regulation of 11 lncRNA expression, and a significant effect on 54 signal pathways. in combination with that result of the above research, the hypoxia signal path and the cell cycle signal path are selected for verification, and the expression of the protein mTOR on the HIF-1 protein can be reduced, the expression of the post-translational modification protein PHD2 and the VHL protein gene is promoted, and the cell cycle related protein (SMC3, CDC25C, CDC6, MCM3) gene expression level. Conclusion: Xihuang Wan can inhibit the expression of hypoxia-related mTOR-HIF-1-Twistl signal, (2) promote the expression of hypoxia-related protein PHD2 and VHL, (3) inhibit the expression of the related protein VE-Cadherin, MMP-2 and EphA2 protein phosphorylation in the blood vessel, and (4) inhibit the expression of SMC3, CDC25C and CDC6. The cell cycle-related gene expression, such as MCM3, can inhibit the proliferation of MGC-803 cells and the formation of angiogenesis in human gastric cancer.
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2498420