【摘要】：食管癌是一種發(fā)病率高的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人類的健康。中國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū),國(guó)內(nèi)90%以上的食管癌是食管鱗癌。研究食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制,有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和診斷、預(yù)后指標(biāo),為食管鱗癌的治療提供新的思路。膠原三螺旋重復(fù)蛋白 1(CTHRC1,College Triple Helix Repeat Containing1)是一種分泌性糖蛋白,可抑制膠原基質(zhì)沉積,促進(jìn)纖維母細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。已有研究證實(shí),CTHRC1的生殖系突變與Barret食管和食管腺癌相關(guān)。在兩個(gè)小樣本量的研究中發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中CTHRC1呈現(xiàn)過表達(dá)。然而其在食管鱗癌的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮的具體作用仍不清楚。我們通過檢測(cè)食管鱗癌樣本中CTHRC1的表達(dá)情況探究CTHRC1在食管鱗癌中的臨床意義,并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)明確CTHRC1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制、CTHRC1對(duì)食管鱗癌表型的影響及其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)顯示在食管鱗癌組織中的CTHRC1的mRNA表達(dá)量顯著高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(差異倍數(shù)=20.5,P = 2.12E-66,Wilcoxon 檢驗(yàn);FDR = 2.93E-64,Benjamini-Hochberg 方法)。同時(shí),我們采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)了 204例食管鱗癌組織(其中169例含有與之配對(duì)的癌旁組織)中CTHRC1蛋白的表達(dá)量,證實(shí)相對(duì)于癌旁組織,大多數(shù)食管鱗癌組織(93.5%,158/169)中CTHRC1蛋白表達(dá)量普遍升高。進(jìn)一步我們進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析證實(shí)食管鱗癌組織中CTHRC1高表達(dá)與T分期(P = 0.043),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P = 0.023),TNM分期(P= 0.024)具有顯著相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析顯示相對(duì)于CTHRC1低表達(dá)的食管鱗癌患者,CTHRC1高表達(dá)的患者總生存期較短,預(yù)后更差(P = 0.020,Log-Rank 檢驗(yàn))。為了探究食管鱗癌中CTHRC1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制,我們通過焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了 50對(duì)食管鱗癌及其配對(duì)癌旁組織的CTHRC1啟動(dòng)子區(qū)(cg07757887)的甲基化程度,數(shù)據(jù)顯示食管鱗癌組織中該位點(diǎn)的甲基化程度顯著低于癌旁組織(n = 50,P0.0001,t檢驗(yàn)),92%(46/50)的食管鱗癌組織中該位點(diǎn)的甲基化程度低于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。采用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-dc)處理食管鱗癌細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)甲基化程度降低的細(xì)胞中CTHRC1的表達(dá)量升高。這些數(shù)據(jù)提示啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低是食管鱗癌中CTHRC1高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)CTHRC1可增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力,敲降CTHRC1則可抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射肺定植實(shí)驗(yàn)則分別驗(yàn)證了 CTHRC1在體內(nèi)對(duì)食管鱗癌的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。接下來,我們對(duì)敲降CTHRC1的KYSE510細(xì)胞及對(duì)照組KYSE510細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序,篩選出差異基因,并對(duì)其進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,富集到 PI3K-Akt 和 MAPK 信號(hào)通路。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲降CTHRC1的KYSE510細(xì)胞和KYSE30細(xì)胞中,p-c-Raf、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)水平明顯降低,CTHRC1過表達(dá)的KYSE450細(xì)胞中,p-c-Raf、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)水平升高,MEK1/2抑制劑U0126可逆轉(zhuǎn)CTHRC1對(duì)KYSE450細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用,支持MAPK/MEK/ERK信號(hào)通路主要介導(dǎo)了 CTHRC1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性表型的促進(jìn)作用。進(jìn)一步,我們通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CTHRC1激活MAPK/MEK/ERK信號(hào)通路,進(jìn)一步活化FRA-1(Fos-related antigen 1)這一重要的轉(zhuǎn)錄因子,從而上調(diào) cyclinD1、snail1、MMP14(Matrixmetallopeptidase14,MT1-MMP)的表達(dá),其中 snail1 介導(dǎo)了 CTHRC1 對(duì)MMP14的上調(diào)作用。食管鱗癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)中CTHRC1的mRNA表達(dá)量與cyclin D1(r = 0.227,P = 0.013)、snaill 的 mRNA(r = 0.550,P0.0001)表達(dá)量均具有顯著正相關(guān)性,snaill的mRNA表達(dá)量與MMP14的mRNA表達(dá)量也具有顯著正相關(guān)性(r = 0.318,P = 0.0004)。免疫組化結(jié)果中CTHRC1表達(dá)量高的患者中,MMP14(P = 0.022)、cyclin D1(P = 0.018)的表達(dá)量顯著較高。生存分析結(jié)果顯示cyclin D1高表達(dá)(P = 0.049)和MMP14高表達(dá)(P = 0.0062)均與食管鱗癌患者不良預(yù)后相關(guān)。綜上所述,CTHRC1在食管鱗癌進(jìn)展過程中發(fā)揮促癌作用,有可能成為食管鱗癌的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2481337