【摘要】：肝癌是世界第五大惡性腫瘤,由于缺乏有效的治療手段,導(dǎo)致其死亡率高居所有癌癥的第二位。肝切除和肝移植是治療肝癌的首選方法,對(duì)于不能手術(shù)切除或腫瘤轉(zhuǎn)移的病人,通常采用化療和放療的治療方法。到目前為止,索拉非尼是唯一被證實(shí)可顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者總生存期的藥物。但是,長(zhǎng)期服用索拉非尼,容易引起耐藥和腫瘤復(fù)發(fā),且高昂的治療費(fèi)用給肝癌患者及其家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此,迫切需要開發(fā)新型的抗肝癌藥物。前期,課題組從天然產(chǎn)物庫中篩選出特異性殺傷肝癌細(xì)胞的天然小分子化合物鴉膽子苦素D。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)鴉膽子苦素D可以劑量和時(shí)間依賴性的抑制肝癌細(xì)胞Huh7增殖,并促進(jìn)其凋亡;小鼠體內(nèi)異種移植瘤實(shí)驗(yàn)也證明該化合物可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。但實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D具有毒性強(qiáng)、治療窗窄等缺陷,限制了其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。研究目的:為了降低鴉膽子苦素D的毒性,本課題對(duì)鴉膽子苦素D進(jìn)行了衍生物的設(shè)計(jì)、合成,希望通過對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,在增強(qiáng)或保持其抗肝癌活性的基礎(chǔ)上,降低其毒副作用,擴(kuò)大其治療窗。由于鴉膽子苦素D的抗肝癌作用靶點(diǎn)不清楚,故按照經(jīng)典藥化思路對(duì)該化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾與抗肝癌活性研究。研究?jī)?nèi)容:1、首先對(duì)鴉膽子苦素D抗肝癌活性的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究,希望在此基礎(chǔ)上,指導(dǎo)新衍生物的設(shè)計(jì)。一方面,針對(duì)鴉膽子苦素D結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,合成得到了衍生物2-1?2-14;另一方面,從天然產(chǎn)物庫中篩選出了鴉膽子苦素D的類似物2-15?2-24。然后用CCK-8方法測(cè)試以上鴉膽子苦素D的25個(gè)結(jié)構(gòu)類似物對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7以及對(duì)正常肝細(xì)胞L-02的增殖抑制活性,根據(jù)活性測(cè)試結(jié)果總結(jié)得到鴉膽子苦素D抑制肝癌細(xì)胞增殖活性的構(gòu)效關(guān)系:1)A環(huán):(1)α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)為抗肝癌活性必需基團(tuán),當(dāng)其被還原或羰基被其它基團(tuán)取代后,衍生物或類似物對(duì)Huh7以及L-02的增殖抑制活性均消失;(2)1位的羥基游離對(duì)活性有利,當(dāng)其成酯后活性降低。2)B環(huán):6位引入乙酰氧基后活性消失。3)C環(huán):(1)14位游離羥基對(duì)活性至關(guān)重要,該羥基失去后活性降低或消失;(2)20位碳原子上引入羥基后,喪失細(xì)胞毒作用選擇性。4)D環(huán):(1)不飽和內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)為活性必需基團(tuán),該內(nèi)酯結(jié)構(gòu)開環(huán)或者轉(zhuǎn)移,活性均消失;(2)15位β-OH可以成酯修飾,這些衍生物的增殖抑制活性與鴉膽子苦素D基本相當(dāng),但是引入乙�；蛄u基,其增殖抑制活性明顯降低,且喪失細(xì)胞毒選擇性。5)E環(huán):呋喃環(huán)為活性必須基團(tuán),開環(huán)或19位引入羥基則增殖抑制活性消失。2、基于初步構(gòu)效關(guān)系結(jié)論,鴉膽子苦素D的15位羥基經(jīng)酯化反應(yīng)引入烷基側(cè)鏈與芳基側(cè)鏈結(jié)構(gòu),合成了33個(gè)鴉膽子苦素D衍生物(3-1?3-33)。在10μm濃度下,測(cè)試這些衍生物對(duì)Huh7細(xì)胞的增殖抑制活性,對(duì)抑制率大于50%的衍生物,進(jìn)一步在不同肝癌細(xì)胞株(Huh7,smmc-7721,hepg-2,qgy-7703)上評(píng)價(jià)其抗肝癌活性,并在正常肝細(xì)胞l-02上評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。最終發(fā)現(xiàn)烷基側(cè)鏈衍生物3-7對(duì)不同肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒選擇性均優(yōu)于先導(dǎo)化合物鴉膽子苦素D,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明3-7可以劑量依賴性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。3、基于拼合原理,設(shè)計(jì)并合成了16個(gè)具有呋咱型No供體結(jié)構(gòu)的鴉膽子苦素D衍生物(4-13?4-30),通過在不同肝癌細(xì)胞株以及正常肝細(xì)胞上進(jìn)行增殖抑制活性評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)衍生物4-21和4-22的對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制活性和鴉膽子苦素D相當(dāng),但對(duì)l-02的抑制活性卻大大降低(ic50均大于100μm)。為了進(jìn)一步探索上述兩個(gè)衍生物的抗肝癌機(jī)制,本文對(duì)衍生物的No釋放能力和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡效果進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果顯示4-21和4-22具有較強(qiáng)的No釋放能力,且可以劑量依賴性的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。4、根據(jù)前藥設(shè)計(jì)原理,鴉膽子苦素D的15-位羥基經(jīng)酯化反應(yīng)引入苯甲�；腿夤瘐；玫窖苌�3-20和3-25,并對(duì)其進(jìn)行體外水解穩(wěn)定性和水解酶歸屬研究,結(jié)果顯示這兩個(gè)衍生物可以選擇性在肝臟羧酸酯酶2的作用下水解釋放出鴉膽子苦素D,實(shí)現(xiàn)了肝靶向功能。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)3-25對(duì)正常肝細(xì)胞l-02的毒性低于3-20,故選擇衍生物3-25進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)評(píng)價(jià)。通過icr小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較鴉膽子苦素D和3-25的毒性,LD_(50)值顯示前藥3-25(LD_(50)=5.9mg/kg/d)的毒性明顯低于鴉膽子苦素D(LD_(50)=2.8mg/kg/d)。最后,通過原位肝癌移植模型對(duì)3-25和鴉膽子苦素D的抗肝癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示:在1.5mg/kg劑量時(shí),這兩個(gè)化合物的藥效相當(dāng),但是3-25的給藥劑量可以提高到3.0mg/kg,且該劑量下其藥效要明顯優(yōu)于1.5mg/kg劑量組。此外,he染色和免疫組化檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)了衍生物3-25在體內(nèi)可以劑量依賴性促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)論:綜上所述,本論文針對(duì)抗肝癌先導(dǎo)化合物鴉膽子苦素D毒性大、治療窗窄的缺陷,通過初步構(gòu)效關(guān)系研究、拼合原理以及靶向前藥等多種衍生物設(shè)計(jì)策略,對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和活性評(píng)價(jià),最終篩選得到4個(gè)衍生物:3-7、3-25、4-21和4-22,它們其對(duì)肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞之間的細(xì)胞毒選擇性要明顯優(yōu)于鴉膽子苦素D,值得對(duì)其進(jìn)一步研究,且有望代替鴉膽子苦素D開發(fā)成為新型的抗肝癌藥物。本論文的研究結(jié)果將為發(fā)現(xiàn)新的抗肝癌先導(dǎo)化合物提供重要的參考價(jià)值,同時(shí)也為其它活性天然產(chǎn)物的藥物化學(xué)研究提供一定指導(dǎo)和借鑒意義。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284;R285
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本文編號(hào)：2476264