【摘要】：中藥配伍是中醫(yī)藥學(xué)的精華部分之一,其獨(dú)特規(guī)律和效用優(yōu)勢已被長期的臨床實(shí)踐所證實(shí),然而迄今仍難以提供其療效的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù),成為了中醫(yī)藥學(xué)獲得國際醫(yī)藥學(xué)術(shù)界認(rèn)同的主要門檻。近年來隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,中藥配伍研究,已經(jīng)取得了不少成績。但由于中藥配伍的復(fù)雜系統(tǒng)中存在多渠道、多角度、多層次的相互作用,使得參考西醫(yī)西藥,以還原論為出發(fā)點(diǎn)的研究模式,難以真正有效地評價復(fù)雜的中藥配伍;缺乏綜合性研究,難以觸及中藥配伍的真正科學(xué)內(nèi)涵;缺乏適合中藥配伍研究的可操作性強(qiáng)、代表性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)思路和技術(shù)方法等問題,使得中藥配伍研究仍然進(jìn)展緩慢。中藥小分子單克隆抗體技術(shù),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷等特點(diǎn),用于中藥配伍研究有其獨(dú)特優(yōu)勢。本研究將應(yīng)用中藥小分子單克隆抗體技術(shù),對芍藥甘草湯進(jìn)行多方面綜合研究,以解析芍藥甘草湯的配伍機(jī)制。目的本研究運(yùn)用中藥小分子單克隆抗體技術(shù),研究劑量比例變化、藥味加減變化對芍藥甘草湯中芍藥苷和甘草酸含量、主要成分的體內(nèi)代謝、藥理藥效等方面的影響,從而解析芍藥甘草湯配伍的"量-時-效"關(guān)系,綜合分析芍藥甘草湯的配伍機(jī)制。方法1.利用芍藥苷單克隆抗體建立芍藥苷在小鼠血中的酶聯(lián)免疫分析法,并進(jìn)行方法學(xué)考察,包括線性、精密度、準(zhǔn)確性、回收率和穩(wěn)定性等。2.建立HPLC同時檢測芍藥甘草湯中芍藥苷與甘草酸含量的方法。3.制備芍藥甘草湯不同配伍比例水煎液(芍藥:甘草分別為1:0.33、1:0.5、1:0.67、1:1、1:1.5、1:2、1:3),HPLC檢測,并計(jì)算其中芍藥苷、甘草酸的含量。將上述各組不同配伍比例的芍藥甘草湯以及芍藥水煎液,灌胃給予昆明小鼠,分別于給藥后 10、20、40、60、80、100、120、150、180、240、300、360 min,12 個時間點(diǎn)從小鼠尾尖取少量血(10 μL),采用酶聯(lián)免疫分析法檢測其中芍藥苷的含量,并繪制時間-濃度曲線,比較各組之間的差異,計(jì)算相關(guān)參數(shù)。用小鼠熱板法致痛模型,考察上述不同配伍比例的芍藥甘草湯及芍藥水煎液的鎮(zhèn)痛藥效隨時間變化情況。用小鼠二甲苯耳腫模型,考察其抗炎藥效。4.制備芍藥甘草湯分別與常用中藥桂枝、柴胡、黃芩、附子配伍的水煎液,HPLC檢測,并計(jì)算其中芍藥苷、甘草酸的含量。將上述各組水煎液以及芍藥甘草湯(芍藥:甘草1:1),灌胃給予昆明小鼠,分別于給藥后10、20、40、60、80、100、120、150、180、240、300、360 min,12個時間點(diǎn)從小鼠尾尖取少量血(10 μL),用酶聯(lián)免疫分析法檢測其中芍藥苷的含量,并繪制時間-濃度曲線,比較各組之間的差異,計(jì)算相關(guān)參數(shù)。用小鼠熱板法致痛模型,考察上述給藥組的鎮(zhèn)痛藥效隨時間變化情況。用小鼠二甲苯耳腫模型,考察其抗炎藥效。5.利用甘草酸單克隆抗體制備甘草酸免疫親和色譜柱,建立芍藥甘草湯中甘草酸的敲除方法,制備敲除甘草酸的芍藥甘草湯樣品。用LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞損傷模型,比較含不同量甘草酸的芍藥甘草湯(150%、1000%、90%、800%、50%、10%、0%組)及甘草酸的抗炎作用和相關(guān)炎癥因子的變化。結(jié)果1.建立了小鼠血中檢測芍藥苷含量的酶聯(lián)免疫分析方法,線性范圍在6.25-800 ng/mL之間,IC50值為41.34ng/mL,板內(nèi)差的變異系數(shù)在4.89%以內(nèi),板間差在11.22%以內(nèi),平均回收率為105.13%,證明所建立的芍藥苷酶聯(lián)免疫分析方法,靈敏度高、精密度與準(zhǔn)確性良好,符合生物樣本中芍藥苷含量測定的需求。2.建立了甘草酸HPLC檢測方法,線性范圍為125-2000μg/mL,R2為0.9992。建立了相同條件下芍藥苷的HPLC檢測方法,線性范圍為5-300μg/mL,R2為1,建立了 HPLC同時檢測芍藥甘草湯中芍藥苷和甘草酸含量的方法,可用于芍藥甘草湯化學(xué)成分的檢測。3.HPLC檢測不同配伍比例的芍藥甘草湯,甘草酸的含量與甘草含量呈線性相關(guān)。雖然芍藥含量不變,但芍藥苷的含量隨甘草含量增加而減少,并在甘草量大于芍藥時受抑制更加明顯。體內(nèi)代謝研究表明芍藥甘草湯中芍藥苷Tmax為60 min左右,芍藥單藥組為40 min左右。在芍藥甘草湯中甘草量小于或等于芍藥量時,芍藥苷Cmax隨著甘草量的增加而增加,當(dāng)甘草量大于芍藥時,芍藥苷Cmax則下降,在芍藥甘草比例1:1時,芍藥苷Cmax最高,為 1.74±1.57 μg/mL。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)表明芍藥組鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)時間在給藥后30 min,芍藥甘草湯不同配伍比例各組鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)時間均在90 min左右,且隨著甘草所占比例增加,痛閾增加值增大,鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間延長。SG7組在給藥后60 min(P0.001),SG4、5、6、7組在給藥后90min(P0.05),SG5、6、7組在給藥后120min(P0.01,P0.05)痛閾增加值與空白組相比均有明顯差異。芍藥甘草湯各比例配伍組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹均有一定抑制作用,在芍藥甘草比為2:1和3:2時腫脹度(P0.001)及腫脹率(P0.05)較模型組降低顯著。4.HPLC檢測結(jié)果表明,與芍藥甘草湯(芍藥:甘草1:1)相比,不同中藥配伍后,甘草酸含量均有明顯下降,芍藥苷含量除在與黃芩配伍組明顯升高外,其他組亦下降。體內(nèi)代謝研究表明,與黃芩、附子配伍組的芍藥苷Tmax為20 min左右,與桂枝配伍組Tmax為40 min左右,芍藥苷達(dá)峰時間均較芍藥甘草湯組提前,而與柴胡配伍組芍藥苷Tmax則延后,為80min左右。與芍藥甘草湯組相比,各組芍藥苷Cmax及AUCtot均有所下降,其中與黃芩配伍組血藥峰濃度最高為1.22±0.24 μg/mL,而與柴胡配伍組AUCtot最高為459.89±92.70μg/mL。與柴胡配伍組芍藥苷MRT最大為985.90±441.34 min,表明柴胡的加入使芍藥苷在體內(nèi)停留時間延長。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)表明,與桂枝配伍組鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)時間在90min(P0.01),與柴胡配伍組鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)時間120 min(P0.05),與黃芩、附子配伍組鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)時間都在60 min(P0.01),四組小鼠的痛閾增加值在各時間點(diǎn)均強(qiáng)于芍藥甘草湯組。與柴胡配伍組痛閾增加值最低,與附子配伍組痛閾增加值最高。芍藥甘草湯1:1比例配伍組、與桂枝配伍組和與黃芩配伍組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹有顯著性抑制作用(P0.05,P0.01),且芍藥甘草湯組抗炎作用最強(qiáng),腫脹抑制率56.69%。與柴胡配伍組和與附子配伍組無明顯抑制腫脹作用(P0.05)。5.利用甘草酸單克隆抗體制備的免疫親和色譜柱,可敲除芍藥甘草湯中的甘草酸及與其結(jié)構(gòu)類似的三萜皂苷類成分。制備不同比例回填液用于LPS干預(yù)的HUVEC細(xì)胞模型,與模型組相比,含100%甘草酸的芍藥甘草湯組及甘草酸組的IL-6和TNF-α的含量都有顯著降低(P0.05),且TNF-α可降至與空白組相當(dāng)水平(P0.05),而其他組對IL-6和TNF-α的影響均不顯著(P0.05)。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)所建立的小鼠血中檢測芍藥苷含量的酶聯(lián)免疫分析方法,線性范圍廣,靈敏度高,重現(xiàn)性好,符合大量生物樣本中芍藥苷含量的測定需求。2.本研究首次從"量-時-效"關(guān)系的角度綜合分析芍藥甘草湯配伍機(jī)制,發(fā)現(xiàn):①甘草量小于等于芍藥時,對芍藥苷的溶出量抑制不顯著,對芍藥苷的體內(nèi)吸收有促進(jìn)作用;當(dāng)甘草量大于芍藥時,對芍藥苷的體外溶出和體內(nèi)吸收均表現(xiàn)出明顯抑制作用。②甘草使芍藥甘草湯鎮(zhèn)痛起效時間延遲,鎮(zhèn)痛作用時間延長。③芍藥甘草湯發(fā)揮鎮(zhèn)痛與抗炎藥效的最佳配伍比例不同。3.首次研究不同藥味配伍對芍藥甘草湯鎮(zhèn)痛抗炎作用"量-時-效"關(guān)系的影響,發(fā)現(xiàn):①與芍藥甘草湯相比,其他藥味加入后,芍藥苷的體外溶出及體內(nèi)吸收大都受到了不同程度的抑制。②芍藥苷代謝達(dá)峰時間與芍藥甘草湯鎮(zhèn)痛作用起效時間相關(guān),提示芍藥苷在中藥復(fù)方的鎮(zhèn)痛藥效中有其獨(dú)特的作用。4.首次運(yùn)用中藥小分子免疫親和色譜柱技術(shù)研究甘草酸對芍藥甘草湯抗炎作用的貢獻(xiàn)度,結(jié)果表明芍藥甘草湯(1:1)抗炎作用與甘草酸相似,但無論甘草酸比例增加或減少都抑制了整體的抗炎作用。說明活性成分在中藥復(fù)方中與其他成分之間發(fā)生相互作用,也存在最佳配伍比例,而并非成簡單的線性關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R289

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本文編號：2473704