【摘要】：目的:臨床中,過(guò)量攝入對(duì)乙酰氨基酚類(lèi)藥物是引起嚴(yán)重肝損的主要原因之一,甚至?xí)䦟?dǎo)致急性肝衰。對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損不僅和藥物用量以及初始肝細(xì)胞損傷程度相關(guān),也與炎癥反應(yīng)相關(guān)。在藥物性肝損害發(fā)展過(guò)程中,肝內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均存在不同程度的激活。在人體中,固有免疫是抵御病原體攻擊的第一道屏障。其主要與PRRs家族的功能相關(guān)。PRRs受體通過(guò)識(shí)別PAMPs或者DAMPs啟動(dòng)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路。在PRRs家族中,TLRs受體是最先被發(fā)現(xiàn)并且深入研究的。TLRs主要存在于巨噬細(xì)胞的中性粒細(xì)胞表面,其激活可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌炎癥因子。Notch信號(hào)通路是一種進(jìn)化非常保守的信號(hào)通路,其在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和再生中發(fā)揮著重要的作用。Notch信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和發(fā)育。在免疫系統(tǒng)中,Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)多種固有免疫細(xì)胞的活性及其功能。在肝臟再生過(guò)程中,激活Notch1及其配體Jagged1可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。而抑制Notch信號(hào)通路可導(dǎo)致更加嚴(yán)重的肝臟損傷。NLRP3炎癥小體是NLR家族中胞內(nèi)識(shí)別受體的一種,其可以被損傷細(xì)胞釋放的PAMPs和DAMPs激活。NLRP3通過(guò)活化caspase-1誘導(dǎo)IL-1β的成熟和釋放,從而調(diào)節(jié)免疫功能。目前,在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損害中Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)功能目前尚不清楚。本課題通過(guò)研究Notch信號(hào)通路在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損害過(guò)程中對(duì)固有免疫免疫功能的調(diào)節(jié)和機(jī)制,闡述Notch信號(hào)通路在藥物性肝損害發(fā)展中的作用。方法:1.通過(guò)在野生型老鼠(WT)和TLR4基因敲除老鼠腹腔中注射對(duì)乙酰氨基酚或者PBS,我們制造了對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)藥物性肝損害的動(dòng)物模型。2.小鼠同時(shí)接受DAPT,Notch信號(hào)通路的抑制劑或者DMSO作為對(duì)照。收集24小時(shí)血清標(biāo)本檢測(cè)ALT,應(yīng)用Western Blot的方法檢測(cè)Hes1、HMGB1、TLR4、NF-κB和NLRP3的表達(dá)以及TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3.在體外實(shí)驗(yàn)部分,骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMMs)從小鼠中提取培養(yǎng)后并轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA,TLR4 siRNA和空白對(duì)照siRNA,然后通過(guò)LPS誘導(dǎo)刺激后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果:1.抑制Notch信號(hào)通路加重了 APAP藥物性肝損傷對(duì)乙酰氨基酚處理24h后,DAPT處理組小鼠的血清ALT為12443±872 IU/L,與對(duì)照組8621±322 IU/L相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。同時(shí),其肝內(nèi)出血和壞死性炎癥更顯著。DAPT處理組小鼠的生存率明顯低于對(duì)照組。2.抑制Notch信號(hào)通路增加了 APAP藥物性肝損中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)DAPT處理組CD68巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)強(qiáng)于對(duì)照組。同時(shí),DAPT處理組的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)MPO為5.31±0.12U/g,較對(duì)照組升高明顯(p0.01)。3.抑制Notch信號(hào)通路抑制了 Hes1但激活了 HMGB1/TLR4/NF-KB和NLRP3 DAPT處理組中Hes1表達(dá)降低。而DAPT處理組中的HMGB1,TLR4,NF-κB和NLRP3的明顯升高,半定量分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。同時(shí),DAPT組中促炎因子IL-1β,TNF-α和IL-6的表達(dá)增加,與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。4.抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)了對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡DAPT處理組中Stat3和Akt的磷酸化被抑制。同時(shí),DAPT組中caspase-3的活性升高。在對(duì)乙酰氨基酚處理后,DAPT組中的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為44.5±1.4 cells/HPF 明顯高于對(duì)照組 24.2±0.9 cells/HPF(p0.001)。5.抑制TLR4信號(hào)通路減輕了對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損并且抑制NLRP3的活性在TLR4 KO老鼠中,DAPT處理組肝臟病理顯示肝組織的炎癥壞死明顯減輕。DAPT處理組NK-κB和NLRP3的表達(dá)升高,caspase-1活性升高。但是在TLR4 KO老鼠中DAPT的處理導(dǎo)致NK-κB和NLRP3的表達(dá)下降,caspase-1亦活性下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。6.體外研究顯示Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB和NLRP3的激活LPS處理后,Notch1 siRNA處理組的Hes1表達(dá)下降,Stat3和Akt的磷酸化被抑制。但是,HMGB1,TLR4,NF-κB和NLRP3的表達(dá)量增加(p0.05)。7.體外研究顯示TLR4對(duì)于Notch調(diào)節(jié)NLRP3起著關(guān)鍵作用DAPT處理導(dǎo)致NK-κB和NLRP3的表達(dá)升高,caspase-1活性升高,但是通過(guò)TLR4 siRNA敲除TLR4后,NK-κB和NLRP3的表達(dá)下降,caspase-1活性減低(p0.05)。結(jié)論:1.抑制Notch信號(hào)通路可以加重對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)藥物性肝損的肝臟損傷,2.抑制Notch信號(hào)通路可以增加巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡;3.抑制Notch信號(hào)通路可以通過(guò)HMGB1/TLR4/NF-κB促進(jìn)NLRP3的活化。因此,本研究發(fā)現(xiàn)了 Notch信號(hào)通路在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)藥物性肝損的固有免疫反應(yīng)中有著極為重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2468207