【摘要】：目的:臨床中,過量攝入對乙酰氨基酚類藥物是引起嚴重肝損的主要原因之一,甚至會導致急性肝衰。對乙酰氨基酚誘導的肝損不僅和藥物用量以及初始肝細胞損傷程度相關,也與炎癥反應相關。在藥物性肝損害發(fā)展過程中,肝內(nèi)巨噬細胞和中性粒細胞均存在不同程度的激活。在人體中,固有免疫是抵御病原體攻擊的第一道屏障。其主要與PRRs家族的功能相關。PRRs受體通過識別PAMPs或者DAMPs啟動炎癥反應信號通路。在PRRs家族中,TLRs受體是最先被發(fā)現(xiàn)并且深入研究的。TLRs主要存在于巨噬細胞的中性粒細胞表面,其激活可以導致巨噬細胞和中性粒細胞分泌炎癥因子。Notch信號通路是一種進化非常保守的信號通路,其在細胞生長、分化和再生中發(fā)揮著重要的作用。Notch信號通路可以調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、存活和發(fā)育。在免疫系統(tǒng)中,Notch信號通路調(diào)節(jié)多種固有免疫細胞的活性及其功能。在肝臟再生過程中,激活Notch1及其配體Jagged1可以促進細胞的生長和分化。而抑制Notch信號通路可導致更加嚴重的肝臟損傷。NLRP3炎癥小體是NLR家族中胞內(nèi)識別受體的一種,其可以被損傷細胞釋放的PAMPs和DAMPs激活。NLRP3通過活化caspase-1誘導IL-1β的成熟和釋放,從而調(diào)節(jié)免疫功能。目前,在對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損害中Notch信號通路的調(diào)節(jié)功能目前尚不清楚。本課題通過研究Notch信號通路在對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損害過程中對固有免疫免疫功能的調(diào)節(jié)和機制,闡述Notch信號通路在藥物性肝損害發(fā)展中的作用。方法:1.通過在野生型老鼠(WT)和TLR4基因敲除老鼠腹腔中注射對乙酰氨基酚或者PBS,我們制造了對乙酰氨基酚誘導藥物性肝損害的動物模型。2.小鼠同時接受DAPT,Notch信號通路的抑制劑或者DMSO作為對照。收集24小時血清標本檢測ALT,應用Western Blot的方法檢測Hes1、HMGB1、TLR4、NF-κB和NLRP3的表達以及TUNEL檢測細胞凋亡。3.在體外實驗部分,骨髓來源巨噬細胞(BMMs)從小鼠中提取培養(yǎng)后并轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA,TLR4 siRNA和空白對照siRNA,然后通過LPS誘導刺激后進行相關檢測。結果:1.抑制Notch信號通路加重了 APAP藥物性肝損傷對乙酰氨基酚處理24h后,DAPT處理組小鼠的血清ALT為12443±872 IU/L,與對照組8621±322 IU/L相比,具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。同時,其肝內(nèi)出血和壞死性炎癥更顯著。DAPT處理組小鼠的生存率明顯低于對照組。2.抑制Notch信號通路增加了 APAP藥物性肝損中炎癥細胞的浸潤DAPT處理組CD68巨噬細胞的浸潤強于對照組。同時,DAPT處理組的中性粒細胞浸潤MPO為5.31±0.12U/g,較對照組升高明顯(p0.01)。3.抑制Notch信號通路抑制了 Hes1但激活了 HMGB1/TLR4/NF-KB和NLRP3 DAPT處理組中Hes1表達降低。而DAPT處理組中的HMGB1,TLR4,NF-κB和NLRP3的明顯升高,半定量分析具有統(tǒng)計學差異(p0.01)。同時,DAPT組中促炎因子IL-1β,TNF-α和IL-6的表達增加,與對照組比較具有統(tǒng)計學差異(p0.05)。4.抑制Notch信號通路促進了對乙酰氨基酚誘導的肝細胞凋亡DAPT處理組中Stat3和Akt的磷酸化被抑制。同時,DAPT組中caspase-3的活性升高。在對乙酰氨基酚處理后,DAPT組中的TUNEL陽性細胞為44.5±1.4 cells/HPF 明顯高于對照組 24.2±0.9 cells/HPF(p0.001)。5.抑制TLR4信號通路減輕了對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損并且抑制NLRP3的活性在TLR4 KO老鼠中,DAPT處理組肝臟病理顯示肝組織的炎癥壞死明顯減輕。DAPT處理組NK-κB和NLRP3的表達升高,caspase-1活性升高。但是在TLR4 KO老鼠中DAPT的處理導致NK-κB和NLRP3的表達下降,caspase-1亦活性下降,具有統(tǒng)計學差異(p0.05)。6.體外研究顯示Notch信號通路調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB和NLRP3的激活LPS處理后,Notch1 siRNA處理組的Hes1表達下降,Stat3和Akt的磷酸化被抑制。但是,HMGB1,TLR4,NF-κB和NLRP3的表達量增加(p0.05)。7.體外研究顯示TLR4對于Notch調(diào)節(jié)NLRP3起著關鍵作用DAPT處理導致NK-κB和NLRP3的表達升高,caspase-1活性升高,但是通過TLR4 siRNA敲除TLR4后,NK-κB和NLRP3的表達下降,caspase-1活性減低(p0.05)。結論:1.抑制Notch信號通路可以加重對乙酰氨基酚誘導藥物性肝損的肝臟損傷,2.抑制Notch信號通路可以增加巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤,誘導肝臟細胞凋亡;3.抑制Notch信號通路可以通過HMGB1/TLR4/NF-κB促進NLRP3的活化。因此,本研究發(fā)現(xiàn)了 Notch信號通路在對乙酰氨基酚誘導藥物性肝損的固有免疫反應中有著極為重要的作用。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：2468207