本文關(guān)鍵詞：針灸對健康小鼠環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制Notch信號通路影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《湖北中醫(yī)藥大學(xué)》 2015年

針灸對健康小鼠環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制Notch信號通路影響的研究

滕迎春  

【摘要】：目的:圍繞針灸改善健康小鼠化療后骨髓抑制、提升外周血白細胞這一主題,進一步揭示針灸對化療后白細胞影響的變化規(guī)律;以Notch信號通路研究為切入點,利用生物芯片篩選CTX健康小鼠骨髓造血細胞中Notch信號網(wǎng)絡(luò)相關(guān)差異基因,應(yīng)用免疫組化法進一步檢測差異基因的蛋白表達,從而進一步篩選出針灸拮抗化療所致骨髓抑制作用中Notch信號通路上的重要信號分子,并運用RT-PCR和Western-bolt方法檢測這些重要信號分子的m RNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白量,從分子生物學(xué)的層面探討針灸抗化療后骨髓抑制的作用機制,為針灸治療化療后骨髓造血功能障礙提供實驗室依據(jù)。方法:選用雄性昆明種SPF級清潔小鼠40只,體重18±2 g,在實驗室自由飼養(yǎng)3天后,稱量各小鼠體重后,運用隨機分層分組的方法將小鼠隨機分到空白組(A組)、模型組(B組)、針刺組(C組)、艾灸組(D組),每組10只。分組后用苦味酸溶液對各組小鼠先染色再進行編號。檢查基礎(chǔ)白細胞計數(shù)后,將兩極小鼠刪除,每組僅保留8只用于實驗的小鼠。依據(jù)《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》(中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局編)的造模方法,用環(huán)磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型。按照100mg/kg/d用藥量腹腔注射,連續(xù)3天。依據(jù)環(huán)磷酰胺藥代動力學(xué)過程,4小時后藥物活性消失,模型即成(中山醫(yī)學(xué)院等編著.基礎(chǔ)藥理學(xué).人民衛(wèi)生出版社,1979:442.)�？瞻捉M小鼠按體重0.02ml/g的用藥量,注入注射用生理鹽水。模型復(fù)制成功后4小時,按照造模的順序進行治療。空白組、模型組只抓取、固定,不治療。針刺組將小鼠俯臥固定于自制木板上,選用華佗牌美容毫針(針具規(guī)格:0.19×10mm,針柄20mm),采用管式進針法,直刺,進針深度為3mm,留針6min,每日1次,連續(xù)5天。艾灸組治療時將小鼠俯臥固定于自制小鼠固定板上,美容細艾條點燃后,(艾條規(guī)格:0.4×25cm),在距離穴位皮膚2cm處固定懸灸,每穴3min,連續(xù)5天,每天治療1次。治療后觀察針灸對白細胞的影響規(guī)律,并應(yīng)用基因表達譜芯片對治療5天后的CTX健康小鼠的骨髓細胞進行Notch信號通路相關(guān)差異基因的初步篩選,再應(yīng)用免疫組化法檢測差異基因的蛋白表達,從而進一步篩選出具有顯著差異的基因,然后對這些顯著性差異基因運用RT-PCR和Western-bolt方法分別檢測其基因m RNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量。通過觀察針灸后CTX健康小鼠Notch信號通路差異基因表達水平的變化,從骨髓細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面探討針灸改善化療后骨髓抑制、提升白細胞的作用機制。整個實驗過程嚴格遵守國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。結(jié)果:1.“實驗一”結(jié)果顯示:造模之前各組小鼠基礎(chǔ)白細胞計數(shù)無顯著差別(P0.05)。造模成功后第2天、第3天小鼠外周血白細胞逐漸下降,與空白組比,其余各組小鼠的白細胞計數(shù)均降低,統(tǒng)計有顯著差異(P0.05);針刺組、艾灸組與模型組相比,白細胞計數(shù)無顯著性差異(P0.05)。治療后第3天,針刺組與艾灸組均開始回升,針刺組效果優(yōu)于艾灸組,且有顯著性差異(P0.05);在第4~5天針刺組、艾灸組白細胞均明顯升高,第5天已達正常值。2.“實驗二”結(jié)果顯示:應(yīng)用基因芯片對各組小鼠骨髓造血細胞Notch信號通路相關(guān)差異基因進行初步篩選,共篩選出7個差異基因:delta1、notch1、notch 2、jag1、jag2、numb1、numb2。3.“實驗三”結(jié)果顯示:治療5天后,與空白組比,模型組中notch2和jag1、jag2上調(diào),numb1和numb2下調(diào),且具有顯著性差異(P0.05);delta1、notch1無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比,針刺組與艾灸組中notch2和jag1、jag2下調(diào),numb1和numb2上調(diào),且具有顯著性差異(P0.05)。與針刺組比,艾灸組中的jag2下調(diào),具有顯著性差異(P0.05)。在基因表達譜芯片篩選出的7個差異基因中又進一步篩選出numb1、numb2、notch 2、jag1這4個具有顯著性差異的基因。4.“實驗四”結(jié)果顯示:健康小鼠注射CTX后,骨髓細胞Notch信號通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2中,與空白組比模型組numb1、numb2 m RNA表達降低,且具有顯著性差異(P0.05),jag1、notch2 m RNA表達升高但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),經(jīng)過治療后雖然與模型組比較針刺組、艾灸組均無統(tǒng)計學(xué)意義,但針刺、艾灸后numb1、numb2 m RNA表達均上調(diào),jag1、notch2 m RNA表達均下調(diào),且艾灸組優(yōu)于針刺組,但無顯著性差異(P0.05)。5.“實驗五”結(jié)果顯示:健康小鼠注射CTX后,jag1、notch2蛋白含量升高,numb1、numb2蛋白含量下降,說明CTX可引起健康小鼠骨髓細胞中的numb蛋白(numb1、numb2)含量下降,導(dǎo)致notch蛋白(jag1、notch2)含量增加。針灸治療5天后,針刺組、艾灸組與模型組比,jag1、notch2蛋白含量下降,且具有顯著性差異(P0.05);針刺組、艾灸組與模型組比,numb2含量增加,且艾灸組具有顯著性差異(P0.05),針刺組、艾灸組與模型組比,numb1蛋白量變化雖無顯著性差異(P0.05),但有升高趨勢,且針刺組較艾灸組高。提示針灸可以通過增加numb蛋白的含量、降低notch蛋白含量。結(jié)論:1.針灸具有減輕CTX健康小鼠骨髓抑制,提升白細胞的作用,且白細胞的變化與導(dǎo)師組多年總結(jié)的變化規(guī)律相一致:即在治療第3天開始回升,在第5天達到正常值,針刺與艾灸兩種方法比較無顯著差異。2.通過基因表達譜芯片和免疫組化的篩選,在各組健康小鼠骨髓造血細胞Notch信號通路上,共篩選出numb1、numb2、notch1、notch2、jag1、jag2、delta1等7個差異基因,其中numb1、numb2、notch2、jag1具有顯著性差異。3.針刺、艾灸可以上調(diào)numb1、numb2 m RNA的表達,下調(diào)notch2、jag1 m RNA表達,可以促進numb1、numb2蛋白含量的增加,降低notch2、jag1蛋白含量。4.針灸減輕CTX化療引起的骨髓抑制,其可能的作用機制是:針灸能夠通過上調(diào)骨髓組織中Numb的含量,下調(diào)notch2、jag1含量,抑制過度激活的Notch信號通路,使骨髓造血干/祖細胞細胞增殖作用增強,分化細胞減少,從而造血干/祖細胞的數(shù)量得以增加,增強骨髓造血功能。5.通過numb-Notch信號途徑的調(diào)節(jié),可能是Notch信號通路起到抗骨髓抑制,提升白細胞,增加機體免疫功能的重要途徑。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R245
【目錄】：

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