【摘要】：目的:以術(shù)后胃癌患者組織標(biāo)本、人胃癌細(xì)胞系為研究對(duì)象,探討GNAQ和MPP8與胃癌患者預(yù)后與臨床病理特征之間的關(guān)系,探討GNAQ和MPP8及其相關(guān)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機(jī)制。方法:1.通過(guò)免疫組化檢測(cè)術(shù)后胃癌患者大體組織標(biāo)本中癌組織和癌旁正常組織GNAQ和MPP8的表達(dá)情況,并比較GNAQ、MPP8表達(dá)情況與患者預(yù)后和臨床特征的關(guān)系。2.建立穩(wěn)定敲減MPP8的人胃癌細(xì)胞MGC803,建立穩(wěn)定敲減MPP8的人胃癌細(xì)胞MGC803,與胃癌細(xì)胞MGC803一起作為研究對(duì)象。3.通過(guò)MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生存活性的變化。4.通過(guò)Annexin V/VAAD雙染應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。5.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)。6.通過(guò)細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移及侵襲能力。7.通過(guò)Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞下游相關(guān)通路蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:第一部分1.GNAQ在胃癌術(shù)后患者的癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(76%vs.51%,p0.001***)。GNAQ與胃癌患者不同臨床特征進(jìn)行比較,結(jié)果顯示:GNAQ在年齡60歲患者中的表達(dá)明顯低于≥60歲患者(68.3%vs.88.5%,p0.001***),在低分化患者的表達(dá)明顯高于中分化患者(87.5%vs.69%,p0.001***),在有輔助治療患者明顯低于無(wú)輔助治療患者(67.7%vs.83.4%,p0.01**),然而對(duì)于不同性別、不同分期及不同腫瘤位置來(lái)說(shuō),GNAQ表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.GNAQ在癌組織中的表達(dá)情況與胃癌患者預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性。GNAQ在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)與GNAQ陰性表達(dá)的患者3年DFS率分別是69.8%和63%(log-rank p=0.496),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;3年OS率分別是65.4%和59.1%(log-rank p=0.430)。不同臨床病理特征的亞組分析結(jié)果也得到相似結(jié)論。為了進(jìn)一步分析GNAQ在胃癌患者中表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系,DFS及OS的單因素及多因素COX回歸分析結(jié)果顯示:分期和分化程度可以作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素,而其他特征不能夠作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。3.敲減GNAQ后胃癌細(xì)胞MGC803生長(zhǎng)受限。監(jiān)測(cè)了5天細(xì)胞的增殖活力情況。從第2天開(kāi)始,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),可見(jiàn)MGC803細(xì)胞在感染了Lv-sh GNAQ后細(xì)胞數(shù)逐漸低于Con和sh Con組;在第5天時(shí)更為明顯,Lv-sh GNAQ組的細(xì)胞數(shù)目分別為sh Con的35%左右,***p0.001。4.敲減GNAQ后胃癌細(xì)胞MGC803克隆形成減少。定量觀察發(fā)現(xiàn),在MGC803細(xì)胞內(nèi),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GNAQ被sh GNAQ特異性敲減后,Con組和sh Con組平均集落數(shù)分別為210±9.2個(gè)、199±5.1個(gè),Lv-sh GNAQ組為5.5±1.2個(gè),***p0.001。5.敲減GNAQ后胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞周期阻滯。定量顯示:與sh Con組相比,sh GNAQ組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低(19.30±0.53%vs.67.58±0.22%,***p0.001),S期細(xì)胞比例明顯增高(68.15±0.42%vs.19.74±0.72%,***p0.001);sh Con、sh GNAQ組細(xì)胞在G2/M期細(xì)胞百分比無(wú)明顯差異(17.33±0.23%,16.62±1.01%,p=0.825)。sub G1期細(xì)胞的比例檢測(cè)結(jié)果顯示:與sh Con組相比,sh GNAQ組sub G1期細(xì)胞比例明顯增高(14.43±0.82%vs.1.23±0.09%,***p0.001)。6.敲減GNAQ的胃癌細(xì)胞MGC803中p53、p21上調(diào),細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A下調(diào),p-CDK2下調(diào);ERK相關(guān)通路分子p-ERK及p-MEK下調(diào)。第二部分1.MPP8在胃癌術(shù)后患者的癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(83%vs.52%,p0.001***)。MPP8的表達(dá)與胃癌患者不同臨床特征進(jìn)行比較,結(jié)果顯示:MPP8在男性患者中的表達(dá)明顯高于女性患者(86.1%vs.75.6%,p=0.035),在III/IV期患者的表達(dá)明顯高于I/II患者期(88.6%vs.79.5%,p=0.046),在中分化患者明顯高于低分化患者(90.2%vs.78.6%,p=0.011),在胃癌患者術(shù)后有輔助治療組高于無(wú)輔助治療組(86.3%vs.80.1%,p0.01)。然而對(duì)于不同年齡和不同腫瘤位置的胃癌患者來(lái)說(shuō),MPP8的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.MPP8在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)的患者傾向于比MPP8陰性表達(dá)的患者更早出現(xiàn)疾病進(jìn)展(復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移),這種情況在低分化的胃癌患者中更加顯著。我們?cè)u(píng)估MPP8的表達(dá)與胃癌患者生存之間關(guān)系,結(jié)果顯示:MPP8在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)與MPP8陰性表達(dá)的患者相比,3年DFS率分別是61.9%和74.5%(log-rank p=0.088),3年OS率分別是66.2%和78.4%(log-rank p=0.087)。亞組分析結(jié)果顯示,這種情況在低分化的胃癌患者中更加顯著,在低分化的胃癌患者中,MPP8陽(yáng)性表達(dá)的患者與MPP8陰性表達(dá)的患者相比,3年DFS率分別為51.8%和72.2%(log-rank p=0.022),3年OS率分別為56.6%和74.5%,(log-rank p=0.017)。為了進(jìn)一步評(píng)估MPP8在胃癌患者中表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系,我們進(jìn)行了DFS及OS的單因素及多因素COX回歸分析。結(jié)果顯示:分期、分化程度、輔助治療可以作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素,而其他特征不能夠作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。3.敲減MPP8后胃癌細(xì)胞MGC803生長(zhǎng)受限。我們監(jiān)測(cè)了5天細(xì)胞的增殖活力情況。從第2天開(kāi)始,可以觀察到MGC803細(xì)胞在感染了Lv-sh MPP8(S1)和Lv-sh MPP8(S2)后細(xì)胞數(shù)逐漸低于Con和sh Con組,第5天時(shí)最為明顯,Lv-sh MPP8(S1)和Lv-sh MPP8(S2)組的細(xì)胞數(shù)目分別為sh Con組的28%和20%左右,**p0.01和**p0.01。4.敲減MPP8后胃癌細(xì)胞MGC803克隆形成減少。在MGC803細(xì)胞內(nèi),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)MPP8被sh MPP8(S1)特異性敲減后,Con組和sh Con組平均集落數(shù)相近,分別為101±7.8個(gè)、96±2個(gè),Lv-sh MPP8(S1)組為23.7±5.7個(gè)。**p0.01。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)MPP8被sh MPP8(S2)特異性敲減后,Con組和sh Con組平均集落數(shù)相近,分別為107.7±9.0個(gè)、100.7±16.8個(gè)。在Lv-sh MPP8(S2)組為7.0±2.6個(gè)。**p0.01。5.敲減MPP8后胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞周期阻滯。定量顯示:與sh Con組相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低(45.10±0.79%和38.54±0.75%vs.51.27±0.79%;**p0.01和**p0.01);與sh Con組相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)組S期細(xì)胞比例明顯增高(42.22±0.44%和45.19±0.78%vs.30.80±0.82%;**p0.01和**p0.01);sh Con、sh MPP8(S1)、sh MPP8(S2)組細(xì)胞在G2/M期細(xì)胞百分比無(wú)明顯差異(17.94±0.94%,16.27±1.47%,12.68±0.85%)。我們又進(jìn)行了sub G1期細(xì)胞的比例檢測(cè)。結(jié)果顯示:與sh Con組相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)組sub G1期細(xì)胞比例明顯增高(24.33±1.17%和36.34±0.28%vs.1.55±0.12%;**p0.01和**p0.01)。6.敲減MPP8后胃癌細(xì)胞MGC803凋亡增加。Annexin V/7AAD雙染sh Con、sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)組MGC803,定量分析:與sh Con相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)組細(xì)胞凋亡比例明顯增加:Annexin V+/7AAD-的細(xì)胞數(shù)量比例分別為25.55±0.56%和24.62±0.32%vs.5.96±0.07%,**p0.01和**p0.01。Annexin V+/7AAD+的細(xì)胞數(shù)量比例分別為40.04±0.61%和64.18±0.23%vs.8.56±0.22%,**p0.01和**p0.01。7.敲減MPP8后胃癌細(xì)胞MGC803遷移和侵襲能力下降。Transwell-migration檢測(cè)con、sh Con、sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)組MGC803細(xì)胞遷移能力。遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:在MGC803細(xì)胞中,sh Con組遷移細(xì)胞數(shù)為109.5±1.5,而sh MPP8(S1)和sh MPP8(S2)組遷移細(xì)胞數(shù)分別為4.7±1.4和77.9±1.7,遷移細(xì)胞數(shù)減少近96%和29%,**p0.01和**p0.01。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示:在MGC803細(xì)胞中,sh MPP8(S1)和sh MPP8(S2)組細(xì)胞數(shù)分別約為sh Con組細(xì)胞數(shù)的24%和63%。**p0.01和**p0.01。8.MPP8調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)通路分子影響胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。敲減MPP8的胃癌細(xì)胞系MGC803中,p53上調(diào),BCL-2下調(diào),BAX上調(diào),PARP上調(diào);敲減MPP8后,N-cadherin下調(diào),維持上皮細(xì)胞支架的E-cadherin仍然正常表達(dá),Vimentin下調(diào)。結(jié)論:第一部分1.GNAQ在胃癌組織高表達(dá)。2.GNAQ敲減后胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖受限、細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加。3.GNAQ通過(guò)p53/p21及MEK/ERK途徑影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。第二部分1.MPP8在胃癌組織高表達(dá),MPP8在癌組織陽(yáng)性表達(dá)的胃癌患者傾向于預(yù)后差,這種情況在低分化胃癌患者中更為顯著。2.MPP8敲減后胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受限,周期阻滯,凋亡增加、侵襲遷移能力下降。3.MPP8通過(guò)p53/Bcl-2及EMT調(diào)節(jié)胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

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1 王軼卓;GNAQ和MPP8及其信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2445615