【摘要】：目的通過制備梔子苷單克隆抗體免疫親和色譜柱,實現(xiàn)對梔子提取液中的梔子苷進行特異性敲除,探討桅子苷與梔子在內(nèi)皮細胞氧化應激損傷保護作用方面的相關性。1.合成梔子苷人工抗原,制備梔子苷單克隆抗體,純化單克隆抗體蛋白。2.利用梔子苷單克隆抗體建立梔子苷酶聯(lián)免疫分析法,考察該方法的精密度、加樣回收率,并進行復方中梔子苷含量的測定。3.制備梔子苷單克隆抗體免疫親和色譜柱,優(yōu)化色譜柱的工作條件,實現(xiàn)對梔子提取液中梔子苷的特異性敲除。4.探討梔子苷及不同梔子苷含量的梔子提取液對H2O2誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)氧化應激損傷保護作用的藥效關聯(lián)性,分析梔子苷對梔子的藥效影響。方法1.選用高碘酸鈉氧化法合成梔子苷人工抗原,動物免疫后檢測血清抗體,進行脾細胞與骨髓瘤細胞的融合,篩選陽性雜交瘤細胞,單克隆化培養(yǎng)后,腹水誘導法量產(chǎn)抗體,辛酸法純化抗體蛋白,對純化后抗體進行效價和特異性檢測。2.棋盤法檢測包被原和一抗的最佳工作濃度,建立梔子苷單克隆抗體的酶聯(lián)免疫分析法,考察該方法的精密度和加樣回收率,與HPLC法檢測結果進行相關性分析,檢測不同配伍含梔子處方中的梔子苷含量。3.利用純化后的梔子苷單克隆抗體,將其偶聯(lián)到活化后的瓊脂糖凝膠上,制備梔子苷單克隆抗體免疫親和色譜柱,優(yōu)化篩選孵育時間、敲除緩沖液和洗脫緩沖液及各緩沖液的流速,考察色譜柱的偶聯(lián)率、柱容量,建立對梔子提取液中梔子苷敲除樣品的液相圖譜,具體條件如下:安捷倫 1260 infinity,Agilent ZORBAX-C18 柱,柱溫 30℃,1ml/min流速,10μl/針進樣量,流動相0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(C),梯度條件0-37min,95%(A)_5%(C);37-60min,85%(A)_15%(C);60-65min,70%(A)_30%(C);65-70min,95%(A)_5%(C)。4.以H202誘導的HUVEC氧化應激損傷模型為載體,通過特異性敲除及定量回填梔子苷的方法,進行梔子苷及不同桅子苷含量的梔子提取液對H202誘導的HUVEC氧化應激損傷細胞活力及NO、NOS、SOD、GSH-px等氧化應激相關指標的藥效關聯(lián)研究。結果1.梔子苷人工抗原合成成功,經(jīng)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)檢測并計算得出梔子苷與BSA的偶聯(lián)比約為34:1.經(jīng)細胞融合篩選成功制備了能分泌梔子苷單克隆抗體的雜交瘤細胞株,SDS-PAGE結果顯示經(jīng)純化除去了腹水中的大量雜蛋白,獲得了較高純度的梔子單克隆抗體,純化前后腹水中的抗體效價均為1:60000左右�？箍贵w與其結構類似物、桅子中其他主要藥物成分、常配伍的中藥化合物均無明顯交叉反應,具有良好的特異性。2.建立了該梔子苷單克隆抗體的酶聯(lián)免疫分析法,線性檢測范圍大致是1μg/mL-50μg/mL,線性回歸方程為 Y=-0.158ln(x)+0.9392,R2=0.9912。IC50 值(即半數(shù)抑制濃度)為6.115μg/mL,最低檢測限約為258 ng/mL。檢測結果與HPLC法的檢測結果相關性好,R2=0.9982。該方法的板內(nèi)差變異系數(shù)和板間差變異系數(shù)均在15%以內(nèi),平均加樣回收率為101.51%,符合生物樣品檢測的需求。3.制備了梔子苷單克隆抗體免疫親和色譜柱,確定以去離子水作為敲除緩沖液,孵育時間設定為60min,敲除液流速為1ml/min,0.1M的甘氨酸-鹽酸緩沖液作為洗脫液,洗脫液流速為2ml/min的反應體系作為該梔子苷免疫親和色譜柱的最適工作條件。抗體蛋白偶聯(lián)率為87.3%,抗體蛋白與柱體的偶聯(lián)比為5.74mg/ml,柱體的容量約為3.25μg/ml。成功建立了梔子苷的敲除方法,制備了特異性敲除梔子苷的梔子提取液樣品。4.通過500μmol/l H202誘導HUVEC 12h建立氧化應激損傷模型,以梔子苷及含有50%、100%、150%、200%梔子苷的梔子提取液分別干預。結果顯示,氧化應激損傷使HUVEC細胞存活率下降至54.037%,細胞培養(yǎng)基中NO含量由36.97pmol/l降至19.86μmol/l,細胞的 NOS、SOD、GSH-px 活性分別由 3.07U/mgprot、37.48U/mgprot、217.40U/mgprot 降至 1.39U/mgprot、23.18U/mgprot、110.87U/mgprot。較之 H2O2模型組,梔子苷以及50%、100%、150%、200%梔子苷含量的梔子提取液均能不同程度地提高細胞存活率,增加培養(yǎng)基中NO含量及NOS、SOD、GSH-px活性,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。并且在50%、100%、150%梔子苷三組中,隨著梔子苷含量的升高,細胞存活率不同程度升高,NO含量及NOS、SOD、GSH-px活性不同程度增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。雖然50%梔子苷組的NOS和SOD活性較100%梔子苷組無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),但數(shù)值上活性有下降趨勢。200%梔子苷組的細胞存活率、NO含量及NOS活性與150%梔子苷組相比沒有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),SOD及GSH-px活性較150%梔子苷組明顯下降(P0.05),繼續(xù)增加梔子苷含量不能進一步提高氧化應激的保護作用。結論本研究制備的梔子苷單克隆抗體具有較強的特異性與親和力,基于該單克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫分析法在檢測結果上與傳統(tǒng)高效液相法的檢測結果相關性良好,可以用于相關樣品中梔子苷的含量測定。在此基礎上制備的梔子苷單克隆抗體免疫親和色譜柱,能夠實現(xiàn)梔子提取液中梔子苷成分的特異性敲除。進一步的藥效關聯(lián)性研究結果顯示,梔子苷及不同梔子苷含量的梔子提取液對內(nèi)皮細胞氧化應激損傷都有不同程度的保護作用,且隨著梔子苷含量的增多,氧化應激保護作用有不同程度的增強,表明梔子苷與梔子在內(nèi)皮細胞氧化應激保護作用上存在一定的藥效關聯(lián)性,對梔子的藥效發(fā)揮有重要影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285
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2426319
