【摘要】：目的:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株HLEB-3,觀(guān)察TGF-β32對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響。2、觀(guān)察不同濃度的NF-K B p65 ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響。3、通過(guò)應(yīng)用NF-K B p65 ASODN在體外轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)由TGF-β32誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響,研究NF-K Bp65AS0DN在體外對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響。4、采用眼前房?jī)?nèi)注射法轉(zhuǎn)移NF-K Bp65AS0DN至新西蘭大白兔后發(fā)性白內(nèi)障模型眼內(nèi),觀(guān)察其對(duì)后發(fā)性白內(nèi)障的作用,探討后發(fā)性白內(nèi)障的基因治療方法。材料和方法:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株HLEB-3,用不同濃度的TGF-β2處理后,在不同的時(shí)間點(diǎn)用細(xì)胞劃痕法觀(guān)察細(xì)胞的移行能力,ELISA法處理細(xì)胞爬片后,檢測(cè)細(xì)胞爬片中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和吸光度值,檢測(cè)α-SMA蛋白的變化。2、將NF-K B p65 ASODN行全程硫代磷酸化修飾,不同濃度的NF-K B p65 ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect兩兩混合,探討細(xì)胞活性不受明顯影響的情況下,最佳的轉(zhuǎn)染效率時(shí)所需的NF-K B p65 ASODN的濃度和轉(zhuǎn)染劑的劑量。3、細(xì)胞同步培養(yǎng)后分五組:(1)空白對(duì)照組(單純FSM培養(yǎng)),(2)陰性對(duì)照組(HiPerFect轉(zhuǎn)染試加入到FSM中共同培養(yǎng)),(3)TGF-β 2組(T組)(10ng/ml TGF-β2) , (4)TGF-β2 加 ASODN 組(T+A 組)(TGF-β2、HiPerFect 轉(zhuǎn)染試和AS0DN加入到FSM中共同培養(yǎng)),(5)TGF-β 2加MS0DN組(T+M組)(TGF-β32、HiPerFect轉(zhuǎn)染試和MS0DN加入到FSM中共同培養(yǎng))。不同組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),6h、12h、24h、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集上清液檢測(cè)α-SMA的含量,采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞NF-K B mRNA的表達(dá)情況。4、將16只新西蘭大白兔進(jìn)行晶狀體囊外摘除術(shù)制作后發(fā)障活體眼動(dòng)物模型,手術(shù)后隨即分為四組,每組4只。A組:空白對(duì)照組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射BSS液100ul; B組:陰性對(duì)照組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul; C組:AS0DN —次注射組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect和10mol / L的NF-K B p65 AS0DN的BSS液100ul; D組:AS0DN兩次注射組4只白兔8眼:術(shù)畢和術(shù)后第2天分別經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect和10mol / L的NF-K Bp65 AS0DN的BSS液100ul。術(shù)后第7、14、21、28天用超聲角膜測(cè)厚儀測(cè)量中央角膜厚度,用裂隙燈顯微鏡觀(guān)察前房炎癥反應(yīng)和后囊膜的混濁情況,并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)行HE染色觀(guān)察后囊膜的病理變化、檢測(cè)α -SMA的表達(dá)和進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞中NF-K B p65 mRNA的表達(dá)。結(jié)果:1、TGF-β 2是晶狀體上皮細(xì)胞重要的促移行和轉(zhuǎn)分化生長(zhǎng)因子,其作用呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。不同濃度的TGF-β 2作用48h后,移行距離隨著TGF-β2濃度的增加而增加,當(dāng)濃度為1Ong/ml時(shí)作用最強(qiáng);晶狀體上皮細(xì)胞在10ng/mlTGF-β2作用下,其移行距離隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在48h達(dá)到高峰。晶狀體上皮細(xì)胞在TGF-β2作用下由單層立方形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,伸出偽足,逐漸呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣形態(tài)。不同濃度的TGF-β 2作用48h后,細(xì)胞爬片中α -SMA的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和吸光度值隨著TGF-β 2濃度的增加而增加,當(dāng)濃度為1Ong/ml時(shí)數(shù)值最大;晶狀體上皮細(xì)胞在1Ong/ml TGF-β 2作用下,細(xì)胞爬片中α-SMA的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和吸光度值隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在48h達(dá)到最大值。2、NF-K B p65 AS0DN對(duì)HLE B-3細(xì)胞的導(dǎo)入率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,48h導(dǎo)入率可達(dá)60%以上,并且細(xì)胞的活性不受影響;隨著濃度增加,NF-KBp65AS0DN對(duì)HLE B-3細(xì)胞的導(dǎo)入率增加,10μ g/ml的轉(zhuǎn)染率最高,再增加濃度轉(zhuǎn)染率增加不明顯,對(duì)細(xì)胞活性影響不明顯;當(dāng)劑量≤3ul時(shí),隨著轉(zhuǎn)染劑HiPerFect的增加,對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率增加,無(wú)明顯細(xì)胞毒性,當(dāng)劑量增加為4u時(shí),對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率增加不明顯,并且表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。HiPerFect的劑量為3ul,AS0DN的濃度為1Onmol / L對(duì)細(xì)胞存活率影響小(80. 4%),同時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70. 8%,為最理想轉(zhuǎn)染條件。3、在6h、12h、24h、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組、T組、T+A組、T+M組上清液α -SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與陰性對(duì)照組相比,T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0. 01);與陰性對(duì)照組相比,T+A組上清液α -SMA的濃度增加不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與T+A組相比,T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01) : T組與T+M組上清液α -SMA的濃度之間的差異不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0. 05)。NF-K B p65 mRNA出現(xiàn)在364 bp處。6h、12h、24h、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組、T組、T+A組、T+M組NF-K B p65 mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01);與陰性對(duì)照組相比,T組、T+M組NF-K B p65 mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01);與陰性對(duì)照組相比,T+A組NF-KBp65mRNA的含量增加不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與T+A組相比,T組、T+M組NF-K Bp65mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0. 01) ; T組與T+M組NF-K B p65 mRNA的含量之間的差異不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、眼前節(jié)炎癥反應(yīng)均在一周內(nèi)消失,組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后1周左右,A、B組開(kāi)始出現(xiàn)后囊膜混濁,隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重,C、D組后囊混濁發(fā)生時(shí)間均遲于A(yíng)、B組,混濁程度也較A、B組為輕,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0. 05)。C、D組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色后觀(guān)察到A、B組后囊表面可見(jiàn)多層成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞排列較為緊密,囊袋周邊部皮質(zhì)增生,同時(shí)可見(jiàn)明顯纖維素樣物質(zhì)沉積,C、D組后囊表面相對(duì)干凈,僅有少量細(xì)胞增殖,細(xì)胞排列較為疏松。A、B組后囊膜α-SMA的表達(dá)量較C、D組明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組和B組之間,C組和D組之間差異不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B組NF-KBp65mRNA的表達(dá)量較C、D組明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組和B組之間,C組和D組之間差異不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1、TGF-β 2可促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞的移行,同時(shí)反應(yīng)細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的α -SMA蛋白的表達(dá)增加,應(yīng)用TGF-β 2刺激體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞可成功建立后發(fā)障的細(xì)胞模型。2、HiPerFect的劑量為3ul, ASODN的濃度為10nmol / L對(duì)細(xì)胞存活率影響小(80.4%),同時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70. 8%,為最理想轉(zhuǎn)染條件。3、NF-K B p65 AS0DN可特異性阻斷NF-K B p65 mRNA的表達(dá),抑制TGF-β 2誘導(dǎo)的α -SMA的表達(dá)和晶狀體上皮細(xì)胞出現(xiàn)移行和間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。4、采用眼前房?jī)?nèi)注射法轉(zhuǎn)移NF-K Bp65AS0DN可抑制新西蘭大白兔后發(fā)性白內(nèi)障模型眼內(nèi)后囊膜上α -SMA的表達(dá)和NF-K B p65 mRNA的表達(dá),抑制后囊膜的混濁,并且不增加炎癥反應(yīng)和對(duì)角膜的影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R77
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本文編號(hào)：
2423475
