【摘要】：目的:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLEB-3,觀察TGF-β32對晶狀體上皮細胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響。2、觀察不同濃度的NF-K B p65 ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect對晶狀體上皮細胞的影響。3、通過應用NF-K B p65 ASODN在體外轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細胞,檢測其對由TGF-β32誘導的晶狀體上皮細胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響,研究NF-K Bp65AS0DN在體外對晶狀體上皮細胞的影響。4、采用眼前房內(nèi)注射法轉(zhuǎn)移NF-K Bp65AS0DN至新西蘭大白兔后發(fā)性白內(nèi)障模型眼內(nèi),觀察其對后發(fā)性白內(nèi)障的作用,探討后發(fā)性白內(nèi)障的基因治療方法。材料和方法:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLEB-3,用不同濃度的TGF-β2處理后,在不同的時間點用細胞劃痕法觀察細胞的移行能力,ELISA法處理細胞爬片后,檢測細胞爬片中的陽性細胞數(shù)和吸光度值,檢測α-SMA蛋白的變化。2、將NF-K B p65 ASODN行全程硫代磷酸化修飾,不同濃度的NF-K B p65 ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect兩兩混合,探討細胞活性不受明顯影響的情況下,最佳的轉(zhuǎn)染效率時所需的NF-K B p65 ASODN的濃度和轉(zhuǎn)染劑的劑量。3、細胞同步培養(yǎng)后分五組:(1)空白對照組(單純FSM培養(yǎng)),(2)陰性對照組(HiPerFect轉(zhuǎn)染試加入到FSM中共同培養(yǎng)),(3)TGF-β 2組(T組)(10ng/ml TGF-β2) , (4)TGF-β2 加 ASODN 組(T+A 組)(TGF-β2、HiPerFect 轉(zhuǎn)染試和AS0DN加入到FSM中共同培養(yǎng)),(5)TGF-β 2加MS0DN組(T+M組)(TGF-β32、HiPerFect轉(zhuǎn)染試和MS0DN加入到FSM中共同培養(yǎng))。不同組細胞繼續(xù)培養(yǎng),6h、12h、24h、48h四個不同時間點收集上清液檢測α-SMA的含量,采用RT-PCR檢測細胞NF-K B mRNA的表達情況。4、將16只新西蘭大白兔進行晶狀體囊外摘除術制作后發(fā)障活體眼動物模型,手術后隨即分為四組,每組4只。A組:空白對照組4只白兔8眼:術畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射BSS液100ul; B組:陰性對照組4只白兔8眼:術畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul; C組:AS0DN —次注射組4只白兔8眼:術畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect和10mol / L的NF-K B p65 AS0DN的BSS液100ul; D組:AS0DN兩次注射組4只白兔8眼:術畢和術后第2天分別經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect和10mol / L的NF-K Bp65 AS0DN的BSS液100ul。術后第7、14、21、28天用超聲角膜測厚儀測量中央角膜厚度,用裂隙燈顯微鏡觀察前房炎癥反應和后囊膜的混濁情況,并于實驗結束時行HE染色觀察后囊膜的病理變化、檢測α -SMA的表達和進行RT-PCR檢測晶狀體上皮細胞中NF-K B p65 mRNA的表達。結果:1、TGF-β 2是晶狀體上皮細胞重要的促移行和轉(zhuǎn)分化生長因子,其作用呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性。不同濃度的TGF-β 2作用48h后,移行距離隨著TGF-β2濃度的增加而增加,當濃度為1Ong/ml時作用最強;晶狀體上皮細胞在10ng/mlTGF-β2作用下,其移行距離隨著作用時間的延長而增加,在48h達到高峰。晶狀體上皮細胞在TGF-β2作用下由單層立方形變?yōu)殚L梭形,伸出偽足,逐漸呈現(xiàn)纖維細胞樣形態(tài)。不同濃度的TGF-β 2作用48h后,細胞爬片中α -SMA的陽性細胞數(shù)和吸光度值隨著TGF-β 2濃度的增加而增加,當濃度為1Ong/ml時數(shù)值最大;晶狀體上皮細胞在1Ong/ml TGF-β 2作用下,細胞爬片中α-SMA的陽性細胞數(shù)和吸光度值隨著作用時間的延長而增加,在48h達到最大值。2、NF-K B p65 AS0DN對HLE B-3細胞的導入率隨時間的延長而增加,48h導入率可達60%以上,并且細胞的活性不受影響;隨著濃度增加,NF-KBp65AS0DN對HLE B-3細胞的導入率增加,10μ g/ml的轉(zhuǎn)染率最高,再增加濃度轉(zhuǎn)染率增加不明顯,對細胞活性影響不明顯;當劑量≤3ul時,隨著轉(zhuǎn)染劑HiPerFect的增加,對細胞的轉(zhuǎn)染率增加,無明顯細胞毒性,當劑量增加為4u時,對細胞的轉(zhuǎn)染率增加不明顯,并且表現(xiàn)出細胞毒性。HiPerFect的劑量為3ul,AS0DN的濃度為1Onmol / L對細胞存活率影響小(80. 4%),同時細胞的轉(zhuǎn)染率可高達70. 8%,為最理想轉(zhuǎn)染條件。3、在6h、12h、24h、48h四個不同時間點與空白對照組相比,陰性對照組、T組、T+A組、T+M組上清液α -SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01);與陰性對照組相比,T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P 0. 01);與陰性對照組相比,T+A組上清液α -SMA的濃度增加不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與T+A組相比,T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P 0.01) : T組與T+M組上清液α -SMA的濃度之間的差異不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0. 05)。NF-K B p65 mRNA出現(xiàn)在364 bp處。6h、12h、24h、48h四個不同時間點與空白對照組相比,陰性對照組、T組、T+A組、T+M組NF-K B p65 mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P 0.01);與陰性對照組相比,T組、T+M組NF-K B p65 mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P 0.01);與陰性對照組相比,T+A組NF-KBp65mRNA的含量增加不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與T+A組相比,T組、T+M組NF-K Bp65mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P 0. 01) ; T組與T+M組NF-K B p65 mRNA的含量之間的差異不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、眼前節(jié)炎癥反應均在一周內(nèi)消失,組間無統(tǒng)計學差異。術后1周左右,A、B組開始出現(xiàn)后囊膜混濁,隨時間延長而逐漸加重,C、D組后囊混濁發(fā)生時間均遲于A、B組,混濁程度也較A、B組為輕,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P 0. 05)。C、D組之間差異無統(tǒng)計學意義。HE染色后觀察到A、B組后囊表面可見多層成纖維細胞生長,細胞排列較為緊密,囊袋周邊部皮質(zhì)增生,同時可見明顯纖維素樣物質(zhì)沉積,C、D組后囊表面相對干凈,僅有少量細胞增殖,細胞排列較為疏松。A、B組后囊膜α-SMA的表達量較C、D組明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義;A組和B組之間,C組和D組之間差異不明顯,無統(tǒng)計學意義。RT-PCR分析結果發(fā)現(xiàn)A、B組NF-KBp65mRNA的表達量較C、D組明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計學意義;A組和B組之間,C組和D組之間差異不明顯,無統(tǒng)計學意義。結論:1、TGF-β 2可促進晶狀體上皮細胞的移行,同時反應細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的α -SMA蛋白的表達增加,應用TGF-β 2刺激體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞可成功建立后發(fā)障的細胞模型。2、HiPerFect的劑量為3ul, ASODN的濃度為10nmol / L對細胞存活率影響小(80.4%),同時細胞的轉(zhuǎn)染率可高達70. 8%,為最理想轉(zhuǎn)染條件。3、NF-K B p65 AS0DN可特異性阻斷NF-K B p65 mRNA的表達,抑制TGF-β 2誘導的α -SMA的表達和晶狀體上皮細胞出現(xiàn)移行和間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。4、采用眼前房內(nèi)注射法轉(zhuǎn)移NF-K Bp65AS0DN可抑制新西蘭大白兔后發(fā)性白內(nèi)障模型眼內(nèi)后囊膜上α -SMA的表達和NF-K B p65 mRNA的表達,抑制后囊膜的混濁,并且不增加炎癥反應和對角膜的影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R77

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本文編號：2423475