發(fā)布時間：2018-12-25 11:56

【摘要】：研究背景和目的納米氧化鈰(CNPs)屬于鑭系金屬元素氧化物,其表面同時存在Ce4+和Ce3+的氧化價態(tài)且可相互轉(zhuǎn)化,因此具有獨特的催化活性及多種生物酶學(xué)模仿活性,能有效清除機(jī)體內(nèi)多種活性氧及活性氮,被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而,未經(jīng)充分表面修飾的CNPs存在著體內(nèi)易團(tuán)聚,易被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)(ERS)清除等缺點,從而限制了其臨床應(yīng)用,因此需要對CNPs表面進(jìn)行生物相容性修飾。然而,大多數(shù)表面修飾物如聚乙二醇(PEG)由于缺乏內(nèi)在親和力而很難穩(wěn)定的吸附于CNPs表面。因此,需要尋找一種錨定分子來“橋接”CNPs與表面修飾物,以此探索一種簡單、有效的CNPs表面修飾方法。正常生物組織暴露于電離輻射會產(chǎn)生大量自由基,損傷正常細(xì)胞及組織。研究報道,CNPs可以有效清除電離輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種自由基,降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,有望成為一種新型的放射防護(hù)劑。然而,未經(jīng)充分表面修飾的CNPs抗輻射活性較低,且副作用較大。因此,有必要評價生物相容性修飾的CNPs對正常細(xì)胞的輻射防護(hù)作用,積極探索一種新型、有效、副作用小的放射防護(hù)劑。光動力學(xué)治療(PDT)是指進(jìn)入特定組織的光敏劑(PSs)在特定波長光的激發(fā)下,與生物分子或氧分子發(fā)生光敏作用,產(chǎn)生大量單線態(tài)氧(1O2)等活性氧,從而光損傷細(xì)胞。作為一種新型非侵襲性治療手段,PDT具有組織特異性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點,在治療良惡性實體瘤及克服腫瘤耐藥方面具有其獨特的優(yōu)勢。然而,大多數(shù)傳統(tǒng)的PSs疏水性較高,腫瘤靶向性較弱。CNPs作為PSs的載藥平臺除具有載藥量大,靶向性高,有效提高PSs的生物相容性,藥效時間長等一般納米材料的優(yōu)點外,其獨特的催化活性、協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)以及優(yōu)秀的儲氧功能亦可增強(qiáng)PDT效應(yīng),因此CNPs-PSs在惡性腫瘤及耐藥性腫瘤的PDT治療中具有巨大的潛力。然而,CNPs在PDT中的應(yīng)用卻很少被研究。因此,設(shè)計一種基于CNPs的PSs載藥系統(tǒng)用于PDT腫瘤治療及腫瘤耐藥性的克服,并深入研究其機(jī)制,以此探索一種基于CNPs的新型、有效、靶向性高、副作用小PDT治療方案,對指導(dǎo)臨床腫瘤PDT的實施具有重要意義。研究方法1、通過微乳液法或高溫分解法合成CNPs,并以阿侖膦酸(AL)作為錨定分子,對CNPs表面進(jìn)行琥珀酸(SA)或PEG修飾;分析修飾前后納米顆粒的分散性、穩(wěn)定性、表面電荷分布、SOD酶模仿活性及細(xì)胞毒性;測定修飾前后納米顆粒在小鼠體內(nèi)的血液循環(huán)滯留時間及臟器分布。2、對比研究裸的CNPs及PEG化的CNPs(CNPs-AL-PEG)對60Coγ射線誘導(dǎo)的正常肝細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS濃度、DNA損傷的影響;分析修飾前后納米顆粒的細(xì)胞攝入量、亞細(xì)胞定位及對細(xì)胞內(nèi)SOD2蛋白表達(dá)的影響。3、通過共價鏈接將聚乙烯亞胺(PEI)嫁接到CNPs-AL-PEG上(PPCNPs),并將光敏分子二氫卟吩(Ce6)共價鍵合到PEI氨基末端,合成多功能納米載藥系統(tǒng)(PPCNPs-Ce6);采用穩(wěn)定性分析、X射線光電能譜(XPS)分析、熒光光譜分析、Zeta電位分析及1O2產(chǎn)生能力分析對材料進(jìn)行化學(xué)表征;對PPCNPs-Ce6的細(xì)胞攝入量及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析;通過細(xì)胞增殖活性分析、細(xì)胞凋亡檢測、細(xì)胞內(nèi)ROS濃度測定、溶酶體功能檢測及透射電鏡觀察,研究PPCNPs-Ce6對宮頸癌細(xì)胞的黑暗化療毒性或在660 nm光照條件下的PDT光損傷效應(yīng)及其機(jī)制;采用腫瘤生長曲線及腫瘤及臟器病理研究PPCNPs-Ce6對荷瘤小鼠的光-化療協(xié)同效應(yīng)。4、在PPCNPs-Ce6的基礎(chǔ)上,鏈接腫瘤靶向性分子葉酸(FA),合成靶向性多功能載藥系統(tǒng)(PPCNPs-Ce6/FA);采用透射電鏡觀察、穩(wěn)定性分析、XPS分析、熒光光譜分析、紅外光譜分析、Zeta電位分析、1O2產(chǎn)生能力分析對材料進(jìn)行化學(xué)表征;通過阿霉素(DOX)攝入量、細(xì)胞增殖活性研究及藥物外排泵P糖蛋白(P-gp)表達(dá)分析,研究基于PPCNPs-Ce6/FA的低劑量PDT對耐藥性乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響;分析PPCNPs-Ce6/FA的細(xì)胞攝入量、亞細(xì)胞定位及對耐藥性乳腺癌細(xì)胞的PDT光損傷效應(yīng);通過細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/-7酶及自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)水平分析、溶酶體膜通透性檢測(吖啶橙染色、凝集素穿孔實驗)、活細(xì)胞成像、透射電鏡觀察、胞內(nèi)ATP含量及Ca2+濃度檢測,研究基于PPCNPs-Ce6/FA的PDT誘導(dǎo)耐藥性乳腺癌細(xì)胞死亡的途徑;活體動物成像、腫瘤生長曲線及腫瘤病理研究PPCNPs-Ce6/FA對荷瘤小鼠的腫瘤靶向性及PDT抗腫瘤效應(yīng);研究尾靜脈注射PPCNPs-Ce6/FA對小鼠血常規(guī)、肝腎功及臟器病理的影響。研究結(jié)果1、CNPs的合成及表面修飾:采用微乳液法及高溫分解法合成的CNPs,粒徑約為3-5 nm;以AL作為錨定分子,成功將SA及PEG修飾于CNPs表面,修飾后的CNPs分散性及穩(wěn)定性顯著提高;CNPs表面修飾能顯著提高納米顆粒表面Ce3+/Ce4+的比率,且隨著修飾鏈長度的增加而升高,導(dǎo)致其SOD酶模仿活性顯著提高,并降低對肝細(xì)胞的毒性;CNPs的PEG修飾能顯著提高納米顆粒在體內(nèi)的血液循環(huán)滯留時間,改善組織分布,進(jìn)而減少其在肝臟特別是脾臟中的蓄積。2、PEG化的CNPs的輻射防護(hù)研究:CNPs-AL-PEG具有良好的分散性及穩(wěn)定性,其表面Ce3+的濃度(46.4%)顯著高于裸的CNPs(37.9%);CNPs及CNPs-AL-PEG都能有效降低電離輻射誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞損傷及凋亡,但CNPs-AL-PEG的輻射保護(hù)效應(yīng)(~86.7%)顯著強(qiáng)于CNPs(~62.4%),提示PEG修飾能有效提高CNPs的輻射防護(hù)效應(yīng);PEG修飾能顯著增強(qiáng)CNPs對電離輻射誘導(dǎo)的O2·-等自由基的清除,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SOD2酶的表達(dá),從而減輕電離輻射對細(xì)胞DNA的損傷;PEG修飾顯著降低細(xì)胞對CNPs的攝取(約400倍),CNPs-AL-PEG進(jìn)入細(xì)胞后分散于胞漿,而裸的CNPs進(jìn)入細(xì)胞后大量團(tuán)聚并集聚于溶酶體,這是裸的CNPs毒性較高且放射防護(hù)效應(yīng)較低的主要原因之一。3、PPCNPs-Ce6對宮頸癌的光-化療協(xié)同效應(yīng):PPCNPs-Ce6具有良好的穩(wěn)定性及生物相容性,PSs加載效率較高(質(zhì)量比Ce6/Ce:~40%);PPCNPs-Ce6顯著增加宮頸癌細(xì)胞Hela對PSs的攝入(10倍),并定位于細(xì)胞溶酶體;PPCNPs-Ce6能被660 nm近紅外激光(NIR)激發(fā)而發(fā)生光敏反應(yīng),超低劑量PPCNPs-Ce6(1μM)下就能有效光損傷腫瘤細(xì)胞,與游離Ce6相比,其PDT效應(yīng)顯著提高;較低劑量PPCNPs-Ce6(3-10μM)在黑暗情況下就能損傷細(xì)胞溶酶體,促進(jìn)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生凋亡,對腫瘤細(xì)胞有顯著的化療毒性;基于PPCNPs-Ce6的同步光-化療能顯著降低抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(腫瘤抑制率104.7%),可克服傳統(tǒng)PDT組織穿透性差的缺點,且無明顯毒副作用,實現(xiàn)了成像介導(dǎo)的光-化療協(xié)同治療宮頸癌。4、PPCNPs-Ce6/FA對耐藥性乳腺癌的靶向光敏作用:PPCNPs-Ce6/FA穩(wěn)定性及生物相容性高,PSs加載效率高;與PPCNPs-Ce6相比,耐藥性乳腺癌MCF-7/ADR對PPCNPs-Ce6/FA的攝入進(jìn)一步提高;PPCNPs-Ce6/FA進(jìn)入細(xì)胞后選擇性的定位于溶酶體,且能被660 nm NIR激發(fā),產(chǎn)生大量ROS;基于PPCNPs-Ce6/FA的低劑量PDT能破壞MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp藥物外排泵,促進(jìn)細(xì)胞對DOX的攝入,從而發(fā)揮光-化療協(xié)同效應(yīng);PPCNPs-Ce6/FA在660 nm光照激發(fā)下,超低劑量(1μM)就能對MCF-7/ADR細(xì)胞發(fā)揮優(yōu)異的光損傷效應(yīng);基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶體靶向的PDT誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬具有明顯的劑量依賴性,光敏化較高濃度的PPCNPs-Ce6/FA(1μM)會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Oncosis方式的死亡,伴隨著細(xì)胞溶酶體膜的破壞、胞膜起泡、細(xì)胞及細(xì)胞器腫脹、胞漿空泡化及能量的快速耗竭;裸鼠荷瘤實驗證明PPCNPs-Ce6/FA具有優(yōu)異的腫瘤靶向性,并能在NIR激發(fā)下顯著抑制腫瘤的生長(腫瘤抑制率96%),發(fā)揮優(yōu)異的抗腫瘤效應(yīng);適當(dāng)濃度PPCNPs-Ce6/FA靜脈全身給藥對動物毒性較小,安全性高。主要結(jié)論1、以AL作為錨定分子,成功將SA及PEG修飾于CNPs表面,修飾后的納米顆粒穩(wěn)定性、生物相容性及SOD酶模仿活性顯著提高,細(xì)胞毒性顯著降低。2、PEG修飾有效改善CNPs的細(xì)胞攝取及亞細(xì)胞定位,提高納米顆粒對輻射誘導(dǎo)的ROS的清除能力,促進(jìn)細(xì)胞SOD2的表達(dá),減輕輻射誘導(dǎo)的DNA損傷,從而增強(qiáng)CNPs對細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)。3、基于CNPs的納米載藥系統(tǒng)(PPCNPs-Ce6)顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞對PSs的攝入,并定位于溶酶體,在特定波長光激發(fā)下超低劑量就能能有效發(fā)揮PDT殺傷腫瘤效應(yīng);同時在黑暗情況下,一定濃度PPCNPs-Ce6能有效發(fā)揮化療毒性,從而實現(xiàn)成像介導(dǎo)的光-化療協(xié)同治療宮頸癌。4、PPCNPs-Ce6/FA進(jìn)一步增強(qiáng)耐藥性乳腺癌對PSs的攝入及光敏效應(yīng),基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶體靶向的PDT能有效克服腫瘤耐藥性,其誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬具有明顯的劑量依賴性,光敏化較高濃度的PPCNPs-Ce6/FA會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Oncosis。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5
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本文編號：2391078