【摘要】：研究背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn),是一種慢性、系統(tǒng)性和破壞性的自身免疫性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。在RA的疾病發(fā)生過程中,中性粒細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用:中性粒細(xì)胞滲出血管并聚集到關(guān)節(jié)部位;中性粒細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞因子、蛋白水解酶等引起機(jī)體正常組織的損傷并可能延緩炎癥反應(yīng)的解決過程;細(xì)胞凋亡是中性粒細(xì)胞從RA炎癥組織中清除并及時(shí)解決炎癥必不可少的條件;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)可促進(jìn)瓜氨酸化自身抗原的產(chǎn)生,而抗-瓜氨酸蛋白抗原導(dǎo)致RA炎癥的持續(xù)存在,并預(yù)示著疾病的更快進(jìn)展和不良預(yù)后。因此,中性粒細(xì)胞是RA治療的重要靶標(biāo)。目前,臨床常用的RA治療藥物主要是非甾體類抗炎藥和改善病情的抗風(fēng)濕藥,如雙氯芬酸、萘丁美酮、甲氨蝶呤、來氟米特等。中藥制劑研究也較多,并且如雷公藤多苷在RA的臨床治療上也有顯著療效。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TⅡA),作為一種從中藥丹參中提取的菲醌衍生物,在臨床上用于很多疾病的治療,如心絞痛、心肌梗死和腦卒中等。丹參酮ⅡA能夠抑制多種組織和細(xì)胞的炎癥反應(yīng),在無菌損傷誘導(dǎo)的斑馬魚驗(yàn)證模型中,丹參酮ⅡA可通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)中性粒細(xì)胞的逆向遷移從而促進(jìn)炎癥的解決。但是丹參酮ⅡA是否能夠通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的活性治療RA目前尚缺乏研究。目的:本研究用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型,評價(jià)丹參酮ⅡA對佐劑誘導(dǎo)的RA小鼠的治療作用及對體內(nèi)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,并檢測丹參酮ⅡA對中性粒細(xì)胞功能的影響,為丹參酮ⅡA可以作為治療RA的一個(gè)有效藥物成分和日后的研究與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)通過弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型探討丹參酮ⅡA對RA的治療作用。(2)用免疫組織化學(xué)法檢測RA小鼠踝關(guān)節(jié)髓過氧化物酶和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的表達(dá)。(3)用小鼠氣囊炎實(shí)驗(yàn)評價(jià)丹參酮ⅡA對中性粒細(xì)胞遷移的影響。(4)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)以及免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測促炎細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、iNOS 水平。(5)用Western Blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平。用Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡。(6)用免疫熒光和共聚焦顯微鏡評估中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的形成,髓過氧化物酶和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放。結(jié)果:(1)丹參酮ⅡA可以緩解RA小鼠的癥狀:我們應(yīng)用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型檢測丹參酮ⅡA是否可以抑制關(guān)節(jié)炎癥。弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的模型組小鼠與正常對照組小鼠相比,踝關(guān)節(jié)腫脹程度、踝關(guān)節(jié)直徑和關(guān)節(jié)炎評分均明顯增高。腹腔注射丹參酮ⅡA的治療組小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕,踝關(guān)節(jié)直徑和關(guān)節(jié)炎評分則顯著下降(P0.01)。(2)RA小鼠踝關(guān)節(jié)組織學(xué)分析:我們發(fā)現(xiàn)弗氏完全佐劑誘導(dǎo)RA模型組小鼠踝關(guān)節(jié)與正常對照組相比出現(xiàn)典型的炎癥表現(xiàn),如軟骨的損傷、滑膜增生和大量的炎性細(xì)胞浸潤。丹參酮ⅡA治療組小鼠的關(guān)節(jié)病理變化則得到明顯改善,軟骨的損傷、滑膜增生得到緩解,炎性細(xì)胞浸潤減少。(3)丹參酮ⅡA對RA小鼠血清中TNF-a和IL-6分泌的影響:經(jīng)ELISA法檢測,小鼠血清中的TNF-a和IL-6的含量,RA小鼠與正常對照組相比有明顯升高。而經(jīng)丹參酮ⅡA治療后,其含量顯著降低(P0.05)。(4)丹參酮ⅡA對小鼠踝關(guān)節(jié)中MPO和NE表達(dá)的影響:經(jīng)免疫組織化學(xué)分析,RA小鼠踝關(guān)節(jié)中MPO和NE的表達(dá)與正常組小鼠相比明顯增多。然而,丹參酮Ⅱ治療組MPO和NE的表達(dá)與RA模型組小鼠相比則明顯減少。(5)丹參酮ⅡA對小鼠中性粒細(xì)胞募集的影響:通過小鼠氣囊炎實(shí)驗(yàn),收集氣囊灌洗液,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù),我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激組的白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)量與PBS組相比顯著增多(P0.01),而經(jīng)丹參酮ⅡA處理后白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)量與LPS刺激組相比則明顯減少(P0.01)。(6)丹參酮ⅡA對中性粒細(xì)胞TNF-α、IL-6的影響:用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR和ELISA法分析丹參酮ⅡA是否能夠降低經(jīng)LPS激活的中性粒細(xì)胞中TNF-α、IL-6的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn),不同濃度(5μM、10μM、25μM)的丹參酮ⅡA處理組與LPS刺激組相比,TNF-α、IL-6的表達(dá)均呈有一定程度的抑制,并且隨丹參酮ⅡA應(yīng)用濃度增大,抑制作用更明顯,其中濃度為10μM和25μM時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。(7)丹參酮ⅡA對中性粒細(xì)胞iNOS的影響:分別用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR和Western Blot檢測了丹參酮ⅡA對經(jīng)LPS激活的中性粒細(xì)胞中iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA處理組與LPS刺激組相比,iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)均被抑制,并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)丹參酮ⅡA對中性粒細(xì)胞凋亡的影響:用Western Blot檢測了 Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA處理組與LPS 激組相比,可以明顯增加Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)(P0.05)。但Bcl-2作為典型的抑制細(xì)胞凋亡的信號,丹參酮ⅡA可以使其表達(dá)明顯減少(P0.05)。流式結(jié)果同樣證明了丹參酮ⅡA可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡。(9)丹參酮ⅡA對中性粒細(xì)胞NETs形成和MPO、NE釋放的影響:通過間接免疫熒光染色后,用激光共聚焦顯微鏡觀察,我們發(fā)現(xiàn),與PMA刺激組相比,丹參酮ⅡA可以明顯抑制中性粒細(xì)胞NETs的形成以及MPO、NE的釋放。結(jié)論:(1)丹參酮ⅡA可以抑制中性粒細(xì)胞向RA炎癥部位的遷移和聚集。(2)丹參酮ⅡA可以減少TNF-α、IL-6、iNOS的表達(dá),從而抑制中性粒細(xì)胞活化。(3)丹參酮ⅡA可以促進(jìn)活化的中性粒細(xì)胞適時(shí)地凋亡,以促進(jìn)RA炎癥的解決。(4)丹參酮ⅡA可以抑制NETs的形成和NETs的形成過程中MPO、NE的釋放,從而減輕RA的炎癥反應(yīng)和組織損傷。這些結(jié)果表明丹參酮ⅡA可以作為治療RA的一個(gè)有效的藥物成分,并且為日后的研究與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2369855