【摘要】：背景:結直腸癌位列全球惡性腫瘤相關死亡率的第四位。診治技術和新藥研發(fā)的不斷進步,將結直腸癌帶入精準化、個體化靶向治療的時代。然而,近年來發(fā)現(xiàn),并不是所有的病人都能夠從目前已有的靶向藥物獲益,因此更多的分子靶點和標志物有待發(fā)現(xiàn),更多的靶向新藥有待研發(fā),更加精準化、個體化的治療手段有待探索。病人來源移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型逐漸廣泛地被應用于多種癌癥的轉化研究。PDX移植瘤模型通過將病人的腫瘤組織直接接種于免疫缺陷裸鼠而建成。已有大量的證據表明,PDX移植瘤模型保留了原腫瘤的組織病理學特征和生長方式特點,有良好的"仿真度"和準確的臨床療效預測能力,可以成為藥物敏感性預測、新藥臨床前試驗、藥物耐藥機制研究以及驗證科研假說等方面成為重要的研究平臺。高通量組學技術(Omics technology),以其高輸出量與高解析度的特性,可以成為探索抗腫瘤藥效反應機制、篩選預測標志物、尋找耐藥解決方案的重要工具。多維度組學技術的結合,可以更為全面、可靠地尋找與臨床表型相對應的分子標記。過去幾年的臨床試驗表明血管靶向藥物抗腫瘤能帶來一定的臨床獲益。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達貫穿于惡性腫瘤整個生長周期,因此VEGF是研發(fā)抗腫瘤血管生成藥物的理想靶點。VEGF靶向藥物已經被證實在多種腫瘤的治療中具有較好的抑制新生血管生成的作用,然而仍然面臨原發(fā)或繼發(fā)耐藥的問題。目前血管靶向藥物經證實有效的藥效預測生物標志物的缺乏成為精準用藥的最大障礙和瓶頸,因此尋找血管靶向藥物的敏感性預測生物標志物成為迫切的需要。另外,如何解決血管靶向藥物原發(fā)或繼發(fā)耐藥成為一個重大的挑戰(zhàn),對血管靶向藥物的耐藥機制的深入研究成為迫切需要。血管靶向藥物聯(lián)合化療藥的抗腫瘤協(xié)同作用的機制是血管靶向藥物具有使腫瘤血管正常化作用從而促進了化療藥物運輸?shù)竭_腫瘤內部組織,血管正�；接邉t協(xié)同作用愈強,而血管正常化的時間窗是由血管靶向藥物的劑量和用藥時間決定的,因此血管正�；谋O(jiān)測分子標志物可以有助于更加合理調整血管靶向藥物聯(lián)合化療藥物的劑量和用法。血管生成素1(Ang-1)以及與之天然對抗的血管生成素2(Ang-2)是血管成熟化、維持和重塑血管結構的最重要的生長因子;Ang-1主要由外膜細胞(還有血管平滑肌細胞和腫瘤細胞)分泌,Ang-2主要由內皮細胞表達。腫瘤血管正�；茄苌纱龠M和抑制之間的不平衡狀態(tài)得到糾正時出現(xiàn)的,而正�；苡奢^多外膜細胞覆蓋。因此,Ang-1/Ang-2比值可以在某種程度上反映這種動態(tài)平衡以及血管外膜細胞的覆蓋程度,是具有潛力的血管正常化監(jiān)測標志物,在血管靶向藥物聯(lián)合化療藥藥效中具有一定的預測價值。FP3(康弘藥業(yè)KH903)是我國自主研發(fā)的一種以VEGF為靶點的全人源化的可溶性受體蛋白,是將VEGFR1的第二個胞外區(qū)域以及VEGFR2的第三、四個胞外區(qū)域與人免疫球蛋白1(IgG1)Fc片段基因融合從而構建的融合蛋白。近期FP3作為眼科藥物已在美國直接開展Ⅲ期臨床試驗,另外,研究亦發(fā)現(xiàn)FP3具有一定的抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤增殖的作用。本論文目標是基于腸癌PDX模型篩選和驗證新型血管靶向藥物FP3抗腫瘤治療的藥效預測標志物,為血管靶向藥物抗腫瘤個體化治療提供研究基礎。第一部分:目的:本部分研究的目的是建立結直腸癌患者新鮮腫瘤組織來源的裸鼠PDX移植瘤模型以作為藥效評估體系。方法:85例結直腸癌患者新鮮腫瘤組織接種于裸鼠皮下用于建立PDX移植瘤模型。HE染色、免疫組織化學染色、50腫瘤相關熱點突變基因二代測序panel以及NANO-LC/MS/MS蛋白質液相二級質譜檢測等方法用于初步鑒定PDX模型與臨床腫瘤組織遺傳分子特征的符合率以及在傳代過程中的生物學穩(wěn)定性。結果:成功建立了結直腸癌患者PDX移植瘤模型50例(成功率58.8%),通過HE染色,CEA、CK7、ki67、VEGF、FGFR2和VEGFR2的免疫組織化學染色對比,以及50腫瘤相關熱點突變基因二代測序pane1和NANO-LC/MS/MS蛋白質液相二級質譜檢測等都表明,結直腸癌PDX移植瘤組織與患者來源腫瘤組織在組織形態(tài)、基因突變狀態(tài)和蛋白表達等方面都顯示出與患者新鮮腫瘤組織高度的一致性。結論:本研究成功建立具有較高臨床仿真度的結直腸癌患者PDX模型,可以成為較好的抗腫瘤藥物評價體系。第二部分:目的:本部分研究基于結直腸癌PDX模型初步評估抗血管靶向新藥FP3單藥及與化療藥聯(lián)合藥效。方法:挑選1例第三代結直腸癌PDX模型,傳代后分為6組:(1)生理鹽水對照組;(2)FP3 組(20mg/kg iv qw);(3)貝伐單抗組(20mg/kg iv qw);(4)鹽酸伊利替康(CPT-11,5mg/kg ip qw)組;(5)FP3(20mg/kg iv qw)聯(lián)合鹽酸伊利替康(5mg/kg ip qw)組;(6)貝伐單抗(20mg/kg iv qw)聯(lián)合鹽酸伊利替康(5mg/kg ip qw)組。然后通過血管免疫熒光觀察CD31標記的血管內皮細胞受抑制情況,以及通過免疫組化觀察用藥后增殖相關抗原ki67的表達變化;另外通過CD31標記血管內皮細胞、α-SMA標記血管外膜細胞,分別觀察FP3單藥和聯(lián)合化療藥作用后腫瘤血管的正常化作用。結果:FP3組與貝伐單抗組有相近的RTI(相對腫瘤抑制率);FP3聯(lián)合CPT-11組與貝伐單抗聯(lián)合CPT-11組有相近的RTI。聯(lián)合用藥組RTI均高于單藥組。FP3用藥后CD31的免疫熒光表達下降,ki67組化表達下降。FP3聯(lián)合CPT-11下調ki67更明顯,而CD31下調程度與單藥作用相近。通過CD31、α-SMA標記免疫熒光觀察,FP3單藥或聯(lián)合化療藥作用后,腫瘤血管均發(fā)現(xiàn)血管正常化作用。結論:FP3單藥可以有效抑制腸癌血管生長,從而抑制腫瘤生長;FP3聯(lián)合CPT-11抑制血管生長方面與單藥FP3相近,抑制腫瘤生長方面具有顯著的協(xié)同作用;FP3單藥和聯(lián)合化療藥療效與BEV相近;FP3作為單藥和聯(lián)合CPT-11用藥作用后都促進腫瘤血管正常化。第三部分:目的:本部分研究基于結直腸癌PDX模型和高通量組學技術篩選和驗證FP3單藥藥效敏感性預測生物標志物。方法:評估FP3單藥高濃度劑量(60mg/kg iv qw)對20例結直腸癌PDX模型的抗血管作用并將各用藥模型區(qū)分為FP3敏感組和不敏感組,進而以多維度高通量組學技術對比檢測差異分子以篩選可能的FP3藥效預測生物標志物并初步驗證標志物的有效性。結果:評估了 FP3對20例結直腸癌PDX模型的抗血管作用并將模型區(qū)分為FP3敏感組和不敏感組,進而以50腫瘤相關熱點突變基因panel二代測序、轉錄組測序以及NANO-LC/MS/MS蛋白質液相二級質譜檢測等3個不同層面的高通量組學檢測以分別檢測FP3藥效敏感組和耐藥組之間差異DNA、RNA和蛋白質,通過生物信息學及文獻檢索發(fā)現(xiàn)3個層面的高通量組學檢測結果在HIF-1α(缺氧誘導因子1α)蛋白表達調控通路上交疊。將此20例模型腫瘤組織檢測HIF-1α免疫組化蛋白表達,發(fā)現(xiàn)高表達組和低表達組有顯著的FP3藥效差異。FP3聯(lián)合HIF-1α抑制劑對單藥最不敏感的模型C70(KRAS突變型,HIF-1α高表達)具有顯著的協(xié)同作用。血管免疫熒光發(fā)現(xiàn)FP3聯(lián)合HIF-1α抑制劑后可以顯著降低新生血管密度,另外免疫組化結果顯示HIF-1α抑制劑能顯著抑制HIF-1α的表達,HIF-1α抑制劑聯(lián)合FP3能夠顯著下調ki-67的表達。進一步,FP3組和HIF-1α抑制劑聯(lián)合FP3組進行了重復實驗,Western blot結果發(fā)現(xiàn)FP3單藥作用于C70第1天VEGF表達下調而第6天表達反跳,聯(lián)合HIF-1α抑制劑后VEGF可以被持續(xù)抑制。結論:研究結果初步確定HIF-1α及相關通路可能為FP3的藥效預測標志物;HIF-1α的高表達促進VEGF持續(xù)表達可能是FP3的耐藥的原因之一,FP3聯(lián)合HIF-1α抑制劑有潛力成為HIF-1α高表達導致FP3耐藥的逆轉治療,有待進一步大樣本驗證和機制研究。第四部分:目的:本部分研究為了初步探究Ang-1/Ang-2在FP3聯(lián)合化療藥藥效中的預測價值。方法:挑選FP3單藥評估耐藥的結直腸癌PDX移植瘤模型,評估FP3不同劑量濃度(7.5、15、30、60mg/kg iv qw)聯(lián)合相同劑量濃度(5mg/kg ip qw)化療藥鹽酸伊立替康(CPT-11)藥效,并分別取第0、7、14、21和28天的血清做ELISA檢測Ang-1/Ang-2比值,從Ang-1/Ang-2比值與不同劑量濃度藥效的對應關系來驗證Ang-1/Ang-2比值作為血管正�；奖O(jiān)測標志物的可靠性。結果:FP3在15mg/kg劑量濃度時聯(lián)合CPT-11表現(xiàn)出最佳協(xié)同作用,通過血清ELISA檢測發(fā)現(xiàn):15和7.5mg/kg FP3聯(lián)合CPT-11治療后血清Ang-1/Ang-2比值都維持在緩慢的升高。15mg/kg FP3聯(lián)合CPT-11治療后血清Ang-1/Ang-2比值較7.5mg/kg高。30和60mg/kg FP3聯(lián)合CPT-11治療后血清Ang-1/Ang-2比值迅速升高。結論:Ang-1/Ang-2比值可以提示血管正常化水平,對FP3聯(lián)合化療藥藥效具有一定的預測價值。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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1 Georgina N.Masoud;Wei Li;;HIF-1α pathway: role, regulation and intervention for cancer therapy[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年05期

2 Verena Stiegelbauer;Samantha Perakis;Alexander Deutsch;Hui Ling;Armin Gerger;Martin Pichler;;MicroRNAs as novel predictive biomarkers and therapeutic targets in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年33期

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本文編號：2355308