【摘要】：應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí),所表現(xiàn)出的非特異性、全身性反應(yīng),是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸激活為主的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。適宜的應(yīng)激反應(yīng)有助于提高機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力,而過度的應(yīng)激則會(huì)引起HPA軸的持續(xù)激活,從而誘導(dǎo)分泌過量的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)。應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生疾病的主要原因之一正是體內(nèi)過高水平的糖皮質(zhì)激素水平。異常分泌的GC與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結(jié)合,導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降,谷氨酸釋放增加,產(chǎn)生興奮性毒性;GC也能夠直接導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮,突觸結(jié)構(gòu)和功能受損,影響突觸可塑性。創(chuàng)新中藥六味地黃苷糖(LW-AFC)是由中醫(yī)“滋補(bǔ)腎陰”的經(jīng)典代表名方——六味地黃方分離得到的、由活性成分群組成的組分中藥,包含多糖(LWB-B)、糖苷(LWD-b)和寡糖(CA-30)三個(gè)活性成分群,已通過國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)正在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)LWAFC的藥理作用和機(jī)制進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究,研究結(jié)果表明LW-AFC對(duì)阿爾茨海默癥(AD)樣認(rèn)知功能障礙、老化樣認(rèn)知功能障礙、多種急性應(yīng)激和皮質(zhì)酮(CORT)所致的學(xué)習(xí)記憶損傷具有明顯的改善作用,其作用與其調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)平衡密切相關(guān)。目前,LW-AFC的三個(gè)活性成分群及其主要活性成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的作用和機(jī)制尚不十分清楚。因此,本課題擬采用急性外源性皮質(zhì)酮皮下注射模型,以長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)為突觸可塑性的代表性指標(biāo),觀察LW-AFC及其活性成分對(duì)突觸可塑性的作用及機(jī)制。第一部分LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的保護(hù)作用研究1.LW-AFC對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的保護(hù)作用研究皮下注射皮質(zhì)酮(CORT,50mg/kg)能夠顯著抑制高頻刺激后群峰電位的增強(qiáng),表明CORT導(dǎo)致了LTP損傷。連續(xù)灌胃LW-AFC 7天對(duì)CORT致LTP損傷具有明顯的保護(hù)作用,且在0.8-3.2g/kg的劑量范圍內(nèi)具有劑量依賴性,而0.4g/kg的LW-AFC對(duì)LTP損傷明顯無保護(hù)作用。2.活性成分群對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用研究進(jìn)而觀察了LW-AFC的三個(gè)活性成分群LWB-B、LWD-b和CA-30對(duì)皮質(zhì)酮導(dǎo)致LTP損傷的影響,結(jié)果表明,與0.8g/kg LW-AFC劑量對(duì)應(yīng)的三個(gè)活性成分群(LWB-B 0.16g/kg、LWD-b 0.12g/kg和CA-30 0.52g/kg)中,僅CA-30對(duì)CORT所致LTP損傷具有明顯保護(hù)作用,而LWB-B和LWD-b無明顯作用;當(dāng)LW-AFC劑量增加至1.6g/kg時(shí),與之對(duì)應(yīng)的三個(gè)活性成分群(LWB-B0.32g/kg、LWD-b 0.24g/kg和CA-30 1.04g/kg)均對(duì)CORT所致LTP損傷具有明顯保護(hù)作用。依據(jù)上述結(jié)果,結(jié)合前期LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠和SAMP8模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的最佳劑量,選取1.6 g/kg劑量的LW-AFC。3.主要活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用研究進(jìn)一步選擇了LWD-b中的馬錢苷(LOG)、莫諾苷(MOR)和芍藥苷(PF)、CA-30中的水蘇糖(STA),觀察了其對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),連續(xù)灌胃LOG(50mg/kg)、MOR(50mg/kg)、PF(50mg/kg)和STA(450 mg/kg)7天均對(duì)CORT所致LTP損傷具有明顯保護(hù)作用。本部分實(shí)驗(yàn)觀察了LW-AFC、三個(gè)活性成分群和主要的活性成分對(duì)CORT致LTP損傷的保護(hù)作用,結(jié)果表明其均對(duì)CORT致LTP損傷具有顯著的保護(hù)作用。第二部分LW-AFC活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用途徑研究第一部分研究已經(jīng)證明,LW-AFC、三個(gè)活性成分群以及主要的活性成分均對(duì)CORT致LTP損傷具有明顯的保護(hù)作用。然而,其保護(hù)作用是直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),還是間接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚不明確。因此,本部分研究采用不同給藥周期和給藥途徑的方式觀察LW-AFC活性成分的作用異同。1.不同給藥周期和途徑對(duì)LW-AFC活性成分作用的影響首先,采用單次側(cè)腦室注射、灌胃和腹腔注射等給藥方式觀察了LW-AFC主要活性成分(LOG、MOR、PF和STA)對(duì)CORT所致LTP損傷的影響。結(jié)果表明,單次給予LW-AFC活性成分均對(duì)LTP損傷無保護(hù)作用。其次,采用多次灌胃和腹腔注射等給藥方式觀察了LW-AFC主要活性成分對(duì)CORT所致LTP損傷的影響。結(jié)果表明,多次給予LW-AFC活性成分對(duì)LTP損傷具有顯著的保護(hù)作用。該結(jié)果提示,LW-AFC主要活性成分可能并非通過直接途徑影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能,而是通過間接途徑發(fā)揮作用。2.腸道菌群和免疫功能對(duì)LW-AFC活性成分作用的影響首先,在多次給予STA實(shí)驗(yàn)中,灌胃STA對(duì)CORT所致的LTP具有明顯的保護(hù)作用,而腹腔注射STA無明顯作用,提示STA可能作用于腸道菌群而間接對(duì)LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用。其次,采用組合抗生素抑制了機(jī)體的腸道菌群,同時(shí)觀察LW-AFC及其主要活性成分對(duì)CORT致LTP損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,組合抗生素抑制了CA-30及STA對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用,而對(duì)LWB-B、LWD-b及其活性成分的作用無明顯影響,進(jìn)一步提示CA-30和STA可能作用于腸道菌群而間接對(duì)LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用,且LW-AFC中三個(gè)活性成分群的作用途徑并不完全一致。最后,采用環(huán)磷酰胺抑制了機(jī)體的免疫功能,同時(shí)觀察LW-AFC及其主要活性成分對(duì)CORT致LTP損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,環(huán)磷酰胺抑制了LWAFC對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用,提示LW-AFC可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而間接對(duì)LTP損傷發(fā)揮作用。綜上所述,該部分研究采用不同給藥周期和途徑的方式,觀察LW-AFC中主要的活性成分對(duì)CORT致LTP損傷的保護(hù)作用。結(jié)果提示,LW-AFC主要活性成分可能通過外周間接途徑對(duì)LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用。組合抗生素抑制了CA-30和STA的作用,提示CA-30和STA可能通過作用于腸道菌群發(fā)揮對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用。免疫抑制劑抑制了LW-AFC的作用,提示LW-AFC可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用。第三部分LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用機(jī)制研究1.LW-AFC及其活性成分對(duì)腸道菌群和腸道免疫功能的影響結(jié)果表明,在門水平上,正常組小鼠腸道菌群主要以擬桿菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻菌門為主,而CORT模型組小鼠腸道菌群主要以擬桿菌門、厚壁菌門和脫鐵桿菌門為主。CORT模型組與正常組比較,其中擬桿菌門水平降低,藍(lán)藻菌門水平降低至小于1%,而脫鐵桿菌門水平明顯升高,提示皮下注射皮質(zhì)酮誘導(dǎo)了腸道菌群結(jié)構(gòu)變化。PCA聚類分析結(jié)果表明正常組與CORT模型組小鼠之間的腸道菌群存在明顯差異,LW-AFC、CA-30和STA在一定程度上恢復(fù)了CORT所致的腸道菌群變化,而LWB-B、LWD-b及其活性成分對(duì)腸道菌群變化無影響。CORT導(dǎo)致小鼠結(jié)腸分泌型免疫球蛋白(SIg A)水平呈下降趨勢(shì),但無顯著性差異。2.LW-AFC及其活性成分對(duì)中樞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響結(jié)果顯示,CORT顯著誘導(dǎo)了谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平的升高,而對(duì)D-絲氨酸(D-ser)水平無顯著影響。LW-AFC、CA-30和STA能夠顯著降低Glu水平,LWB-B、LWD-b和LOG具有降低Glu水平的趨勢(shì),但無顯著性差異。LW-AFC及其活性成分同樣具有低GABA水平的趨勢(shì)。LW-AFC能夠顯著促進(jìn)D-ser水平的升高。3.LW-AFC及其活性成分對(duì)D-ser代謝通路的影響結(jié)果顯示,CORT顯著誘導(dǎo)了海馬組織中葡萄糖水平、3-磷酸甘油酸脫氫酶(PHGDH)、Na+依賴的丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(Asc-1)和囊泡相關(guān)蛋白2(VAMP2)蛋白表達(dá)水平的降低,以及絲氨酸消旋酶(SR)蛋白表達(dá)水平的升高。LW-AFC及其活性成分能夠促進(jìn)葡萄糖水平、PHGDH、Asc-1和VAMP2蛋白表達(dá)水平的升高,以及SR蛋白表達(dá)水平的降低。綜上所述,在外周系統(tǒng),CORT誘導(dǎo)了腸道菌群的變化;在中樞神經(jīng)系統(tǒng),CORT誘導(dǎo)Glu和GABA的大量積累,以及影響了NMDA受體輔助激動(dòng)D-ser的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌,導(dǎo)致NMDA受體功能降低,進(jìn)而損傷突觸可塑性。LWAFC、CA-30和STA能夠一定程度上恢復(fù)CORT導(dǎo)致的腸道菌群改變,具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用;LW-AFC及其部分活性成分能夠降低Glu水平、升高D-ser水平,調(diào)節(jié)D-ser的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌,促進(jìn)了NMDA受體功能,從而對(duì)CORT所致的LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用。通過以上三部分研究,本論文研究主要得出以下結(jié)論:1.單次給藥LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷沒有明顯作用,多次給藥可明顯發(fā)揮對(duì)皮質(zhì)酮所致LTP損傷的保護(hù)作用,免疫抑制劑可阻斷其對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用,提示LW-AFC及其活性成分是通過調(diào)節(jié)免疫功能間接發(fā)揮作用。2.抗生素抑制腸道菌后可明顯抑制CA-30對(duì)LTP的保護(hù)作用,但對(duì)其他活性成分無明顯影響,提示LW-AFC及其活性成分是通過腸道菌等不同途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。3.調(diào)節(jié)中樞D-絲氨酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié),進(jìn)而降低NMDA受體功能是皮質(zhì)酮致LTP損傷的重要因素之一;LW-AFC及其活性成分可通過對(duì)D-絲氨酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮其對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的保護(hù)作用。本研究對(duì)于明確LW-AFC的物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍研究及作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ),也為中藥復(fù)方研究提供了借鑒;首次闡明了D-絲氨酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌等通路是皮質(zhì)酮致LTP損傷重要機(jī)制,為防治應(yīng)激等所致認(rèn)知功能損傷提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)和策略,具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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2 廖清江;;醛皮質(zhì)酮的甾體對(duì)抗物Ⅱ[J];南藥譯叢;1960年02期

3 廖清江;;48.醛皮質(zhì)酮的甾體對(duì)抗物Ⅲ.[J];南藥譯叢;1960年04期

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本文編號(hào)：2352034