【摘要】：研究背景及目的:前列腺癌(PCA)是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,在全世界癌癥死亡原因排第二位,特別是在西方國(guó)家。雖然前列腺癌的早期診斷和預(yù)防取得了很大進(jìn)展,但發(fā)病率和死亡率仍在不斷增加�；颊弑辉\斷為前列腺癌時(shí)多為晚期,其特征在于癌細(xì)胞可能會(huì)從前列腺內(nèi)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。不同的臨床病理特征,如血清前列腺特異性抗原(PSA)、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)階段和Gleason評(píng)分,已被廣泛地用于將前列腺癌患者分為不同的危險(xiǎn)組。然而,這些參數(shù)都有局限性,不能作為唯一的標(biāo)準(zhǔn)。因此,有必要尋找更準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)前列腺癌的診斷和預(yù)后。轉(zhuǎn)錄因子12(TCF12,也稱為HEB或HTF4,為螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)蛋白家族的一員,具有DNA結(jié)合能力(E-box)。TCF12蛋白被發(fā)現(xiàn)在許多組織中廣泛表達(dá),可以形成同源或異源二聚體。在功能上,TCF12負(fù)責(zé)細(xì)胞的發(fā)育和分化。據(jù)報(bào)道,TCF12可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的分化或間充質(zhì)的發(fā)育;基因突變的基因與其它分子片段的易位融合可導(dǎo)致顱縫早閉或間質(zhì)腫瘤。越來(lái)越多的證據(jù)表明,TCF12功能在多種人類腫瘤可能是癌基因或抑癌基因。例如,He等發(fā)現(xiàn),膽囊癌患者組織中TCF12表達(dá)升高與較差的總生存期相關(guān);Tang等表明,腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中TCF12明顯升高,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重塑和引發(fā)乳腺癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移;Lee等確定TCF12可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān);與此相反,Chen等人確定TCF12為口腔鱗狀細(xì)胞癌中mir-211的直接靶標(biāo),并證實(shí)它的功能為抑制這種惡性腫瘤的致癌性。然而,TCF12在前列腺癌中的表達(dá)情況和分子生物學(xué)功能尚不清楚。近來(lái),小分子RNA(microRNAs,miRNAs)在各種腫瘤中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。miRNAs調(diào)控了人類超過(guò)一半的編碼蛋白的基因,它們的功能紊亂或表達(dá)水平異常與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。目前,許多研究表明miRNAs在前列腺癌中扮演重要的角色,如miR-30d、miR-373和miR-520c。所以,miRNAs是研究前列腺癌分子機(jī)制的重要組成部分及潛在治療靶點(diǎn)。miR-30d已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),并發(fā)揮關(guān)鍵的促癌作用,包括黑色素瘤、肝細(xì)胞癌、肺癌和周圍神經(jīng)鞘瘤。證實(shí)了 miR-30d可通過(guò)直接調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)從而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能過(guò)程,例如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和血管生長(zhǎng)等,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,并最終影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。一般認(rèn)為,miRNAs的生物學(xué)功能具有高度的組織和細(xì)胞特異性,miR-30d也不例外。既往的研究和我們先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了 miR-30d在前列腺癌中表達(dá)上調(diào),并發(fā)揮關(guān)鍵的促癌作用。因此,我們利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)過(guò)表達(dá)miR-30d和NC對(duì)照的LNCaP和DU145細(xì)胞株進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,獲得一批miR-30d調(diào)控的差異表達(dá)下調(diào)的基因,使用軟件預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在表達(dá)下調(diào)基因中篩選與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因,并鑒定了 TCF12作為候選基因。作為螺旋-環(huán)-螺旋蛋白家族的一個(gè)成員,TCF12在多種人類腫瘤作為一個(gè)癌基因或抑癌基因。然而,TCF12是否參與前列癌目前并沒(méi)有任何報(bào)道。我們首先采用免疫組化法鑒定前列腺癌和良性前列腺增生組織標(biāo)本中TCF12蛋白的表達(dá)。探討TCF12與前列腺癌的臨床相關(guān)性,探討TCF12在前列腺癌中的作用,然后對(duì)TCF12的表達(dá)與各種臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行評(píng)估分析。此外,分別通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定它在腫瘤細(xì)胞的增殖,遷移,侵襲和腫瘤生長(zhǎng)的作用。材料:1.人臨床組織來(lái)源:50例人的前列腺癌組織芯片(Tissue microarrays,TMA)購(gòu)自西安艾利林生物科技有限公司(西安,中華人民共和國(guó);目錄號(hào):PR807a)。排除手術(shù)前已行化療或放療的患者。為了評(píng)估TCF12與前列腺癌的臨床相關(guān)性,我們使用Taylor數(shù)據(jù)庫(kù),它是一個(gè)公用的數(shù)據(jù)平臺(tái),其中miRNA表達(dá)譜芯片包含帶有臨床隨訪數(shù)據(jù)的150個(gè)原發(fā)性前列腺癌組織和29例癌旁良性前列腺組織[14];其中前列腺癌組織miRNA表達(dá)譜芯片包含有詳細(xì)臨床隨訪數(shù)據(jù)的113個(gè)原發(fā)性前列腺癌病例。2.動(dòng)物:BLAB/c裸鼠8只,雄性,4-6周齡,購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。3.細(xì)胞株:兩種人前列腺癌細(xì)胞株(DU145和LNCaP)是2012年從美國(guó)馬納薩斯(Manassas,VA,USA)的 American Type Culture Collection(ATCC)公司購(gòu)買獲得。方法:1.構(gòu)建miR-30d、TCF12抑制表達(dá)和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(Danvers,MA,USA),并用TransDux病毒轉(zhuǎn)染試劑(型號(hào):LV850A-1,SBI,USA)將其轉(zhuǎn)染到DU145和LNCaP細(xì)胞株中。2.利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)過(guò)表達(dá)miR-30d和NC對(duì)照的LNCaP和DU145細(xì)胞株進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,獲得一批miR-30d調(diào)控的差異表達(dá)下調(diào)的基因。使用軟件預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在表達(dá)下調(diào)基因中篩選與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因。3.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-30d、TCF12抑制表達(dá)和過(guò)表達(dá)在DU145和LNCaP細(xì)胞株中的表達(dá)情況,并驗(yàn)證抑制表達(dá)和過(guò)表達(dá)miR-30d的LNCaP和DU145細(xì)胞株中miR-30d和TCF12之間的表達(dá)相關(guān)性。4.利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,分析Taylor臨床前列腺癌組織miRNA芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中TCF12表達(dá)水平與前列腺癌患者的臨床特征以及預(yù)后的相關(guān)性,如PSA水平、Gleason評(píng)分、是否生化復(fù)發(fā)等。通過(guò)生存曲線分析及Cox回歸分析,分別研究TCF12的表達(dá)與總體生存率、無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系及其它指標(biāo)對(duì)前列腺癌總體生存及無(wú)生化復(fù)發(fā)生存的影響,是否可以作為預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。5.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)分析TCF12基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等功能的影響,包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)等。裸鼠皮下接種過(guò)表達(dá)DU145細(xì)胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析TCF12在體內(nèi)對(duì)前列腺癌成瘤的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。連續(xù)變量以X±s的形式展示。計(jì)數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn)。qRT-PCR、免疫組化、Western blot和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)等定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)上兩組數(shù)據(jù)之間的比較。LSD法用于兩個(gè)以上分組的組間兩兩比較。Taylor臨床前列腺癌組織芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中TCF12基因表達(dá)水平和前列腺癌患者的臨床特征之間的關(guān)系通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通過(guò)Kaplan-Meier方法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行前列腺癌患者臨床生存分析。COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素和多因素分析評(píng)估TCF12是否能作為預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.在過(guò)表達(dá)miR-30d的基因表達(dá)譜分析中,我們獲得25個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因,其中包括TCF12。此外,我們進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析,結(jié)果顯示與空白載體對(duì)照組相比,TCF12和miR-30d在蛋白質(zhì)表達(dá)水平中存在負(fù)相關(guān)。2.組織芯片免疫染色分析顯示前列腺癌組織標(biāo)本的TCF12低表達(dá)與高Gleason評(píng)分顯著相關(guān)(P=0.009)。由于前列腺癌組織標(biāo)本(TMA數(shù)據(jù))不包括更多的臨床病理特征,如術(shù)前PSA水平,總生存,生化復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)移和病理分期等,我們使用前列腺癌臨床芯片數(shù)據(jù)集(Taylor公用數(shù)據(jù)庫(kù))來(lái)分析TCF12表達(dá)水平與臨床特征之間的關(guān)聯(lián)和前列腺癌患者的預(yù)后,結(jié)果顯示TCF12的下調(diào)表達(dá)與Gleason評(píng)分、術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移和生化復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.025,0.001和0.019),而TCF12表達(dá)水平與年齡、術(shù)前PSA水平、是否死亡和病理分期之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性。3.Kaplan-Meier法和Log rank法分析評(píng)價(jià)TCF12表達(dá)在前列腺癌預(yù)后中的價(jià)值,結(jié)果顯示低表達(dá)TCF12與前列腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān),高表達(dá)和低表達(dá)TCF12的前列腺癌患者的總體生存率沒(méi)有顯著差別(P=0.737),而TCF12高表達(dá)組的患者其生化復(fù)發(fā)率低于TCF12低表達(dá)組的患者(P = 0.004),說(shuō)明TCF12低表達(dá)可能是生化復(fù)發(fā)的一個(gè)危險(xiǎn)因素。COX回歸模型單因素和多因素分析結(jié)果提示,TCF12基因表達(dá)水平[P=0.046]、Gleason評(píng)分[P0.001]和病理分期P=0.012]是前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。4.成功構(gòu)建TCF12過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TCF12蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示TCF12過(guò)表達(dá)的蛋白水平顯著高于NC組(P0.05),而TCF12下調(diào)表達(dá)的蛋白水平顯著低于NC組(P0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染效果良好。體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示TCF12過(guò)表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的遷移、增殖和侵襲能力相對(duì)空白對(duì)照組明顯減弱(P0.05)。相反,TCF12抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的遷移、增殖和侵襲能力相對(duì)對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P0.05)。5.裸鼠皮下移植瘤模型顯示TCF12過(guò)表達(dá)能夠顯著性抑制由DU145形成的移植瘤的成瘤大小和生長(zhǎng)速度(P0.05),證實(shí)過(guò)表達(dá)TCF12抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖。結(jié)論:1.TCF12在前列腺癌中是一個(gè)重要的抑癌基因,抑制前列腺癌進(jìn)展,并作為獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)預(yù)測(cè)前列腺根治性切除后生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。2.前列腺癌組織標(biāo)本的TCF12低表達(dá)與高Gleason評(píng)分顯著相關(guān),有望通過(guò)檢測(cè)前列腺癌組織中TCF12的表達(dá)水平,協(xié)助傳統(tǒng)的臨床病理指標(biāo)更準(zhǔn)確地區(qū)分低度惡性和高度惡性的前列腺癌,優(yōu)化治療方案。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

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4 張立e，

本文編號(hào)：2326271