【摘要】：鎘(Cadmium,Cd)是一種有毒重金屬,廣泛存在于土壤、水質(zhì)、空氣中。環(huán)境中的Cd不能被生物代謝降解,導(dǎo)致Cd經(jīng)食物鏈傳遞不斷蓄積在動物及人體內(nèi)。Cd因其理化特性與鋅相似,容易取代體內(nèi)的鈣、鋅、鎂等離子,在機(jī)體內(nèi)長期蓄積而引發(fā)疾病。Cd致機(jī)體損傷的程度依賴于進(jìn)入機(jī)體的Cd的劑量、存在形式及暴露時間,進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的Cd可經(jīng)血液循環(huán)分布于全身各處,特別是腎、肝、脾、胸腺、骨等器官。腎小管的重吸收作用導(dǎo)致Cd在腎臟內(nèi)大量蓄積,誘發(fā)組織細(xì)胞損傷、線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。目前,Cd中毒的防治主要以重金屬螯合劑及抗氧化劑為主,也有研究表明多種中草藥提取物可防治慢性Cd中毒所致的腎損傷、改善慢性中毒癥狀。蕨麻是一種食藥兩用型傳統(tǒng)中藥,含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),其中蕨麻多糖(Potentilla anserina polysaccharides,PAP)因其具有明確的生物學(xué)活性而受到關(guān)注,在體內(nèi)及體外實驗中均被證實具有抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用。目的:基于PAP具有抗氧化、抗凋亡及調(diào)節(jié)免疫等生物活性,對Cd所致的損傷具有針對性,本研究擬建立Cd染毒細(xì)胞及動物模型,觀察分析Cd在細(xì)胞及器官內(nèi)的分布及定量;PAP干預(yù),探討PAP對Cd所致細(xì)胞及動物腎毒性的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:1.水提醇沉法提取PAP,Sevage法脫蛋白純化,紅外光譜分析法、苯酚-硫酸法及HPLC法檢測。2.建立Cd染毒細(xì)胞及動物模型,合成Cd2+熒光探針,激光共聚焦顯微技術(shù)定位并半定量分析細(xì)胞及動物臟器內(nèi)的Cd2+分布,HE染色觀察各器官的組織病理學(xué)改變。3.建立Cd染毒HEK293細(xì)胞模型,PAP干預(yù),CCK-8法測定細(xì)胞活力,熒光染色觀察細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、活性氧水平,ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD、MDA、ATP水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,Western blotting實驗檢測線粒體合成及功能相關(guān)蛋白、內(nèi)源性及外源性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。4.建立急性及慢性Cd染毒動物模型,PAP干預(yù),免疫組化染色法及Masson’s染色法觀察腎臟組織病理學(xué)改變、纖維化進(jìn)展,采用上述方法測定腎臟功能、氧化還原狀態(tài)、線粒體功能及合成相關(guān)蛋白、內(nèi)外源性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.青海玉樹蕨麻提取樣品中多糖含量可達(dá)64.22%,PAP提取樣品中含有糖類的特征基團(tuán),其主要單糖組分包括葡萄糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖和木糖。2.熒光探針染色表明Cd2+彌散分布于胞質(zhì)中,在部分特定的細(xì)胞器呈密集分布。熒光染色顯示小鼠體內(nèi)以腎臟中Cd2+蓄積量最高,且Cd2+主要分布于腎小管上皮細(xì)胞內(nèi),其次為肝、脾、胸腺及睪丸。3.PAP可改善Cd染毒細(xì)胞的細(xì)胞活力、減少細(xì)胞壞死及凋亡;升高GSH及SOD水平、降低ROS及MDA含量,改善氧化還原狀態(tài);恢復(fù)線粒體膜電位及ATP水平,調(diào)控PGC-1α和Nrf2蛋白表達(dá);降低Cd染毒細(xì)胞的凋亡率,并可上調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)及bcl-2/bax比值,下調(diào)γH2ax、p-p53、cytochrome C、Cleaved-Caspase 3及Fas蛋白的表達(dá),其抗凋亡作用可能涉及調(diào)控線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑及死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑。4.PAP可改善急、慢性Cd染毒小鼠腎臟指數(shù),恢復(fù)腎臟功能,提高GSH水平、降低MDA含量,調(diào)控腎臟細(xì)胞PGC-1α及Nrf2表達(dá),緩解腎臟組織病理學(xué)改變及腎臟纖維化進(jìn)展,上調(diào)bcl-2/bax蛋白表達(dá)比值,下調(diào)Fas蛋白表達(dá),可能參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源性及外源性凋亡途徑對抗Cd誘導(dǎo)的腎臟組織細(xì)胞凋亡。結(jié)論:PAP可改善Cd所致的細(xì)胞損傷、腎功能降低、線粒體完整性及線粒體功能下降、核DNA損傷、減輕Cd誘導(dǎo)的腎臟組織病理學(xué)改變,具有抗氧化及抗凋亡的作用,對Cd所致的腎毒性具有較明顯的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2320325