發(fā)布時間：2018-11-03 17:55

【摘要】：白果為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的干燥成熟種子。長期以來作為藥食同源之品,但歷代本草都有"白果有毒"的記載,在長期的實踐中已證實大量食用白果后會產(chǎn)生劇烈的毒性反應,甚至危及生命。然而,白果毒性物質基礎不夠明確、致毒機理不甚清晰,導致其安全食用受到限制,也制約了我國這一寶貴食藥兩用資源的價值體現(xiàn)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。鑒于此,本論文以白果多元毒性物質的分析評價為基礎,開展了主要毒性成分銀杏酸及吡哆醇的毒性表征及體內過程研究,并進一步通過對白果加工工藝的考察及優(yōu)化,對白果加工過程中的減毒方法及機制進行了研究,為安全食用白果的產(chǎn)業(yè)化開發(fā),提供科學依據(jù)。本論文研究工作為國家科技支撐計劃項目"銀杏葉系列產(chǎn)品質量標準提升及銀杏資源綜合開發(fā)利用"(2011BAI04B03)的后續(xù)研究工作;國家自然科學基金項目"基于構-量-毒關系的白果復合毒性物質基礎及其致毒機理研究"(81673532)的部分研究內容。一、文獻研究通過對白果相關文獻的梳理和歸納,總結目前白果毒性研究的現(xiàn)狀及毒性中藥的研究方法,以期用現(xiàn)代的毒性研究方法,對白果毒性物質基礎及體內過程的研究提供科學參考。二、實驗研究(一)白果多元毒性物質的分析評價通過建立相應的檢測方法,對白果中的主要毒性物質銀杏酸類、吡哆醇類及氰類化合物進行定性定量分析。采用對照提取物法對白果中銀杏酸類成分進行測定,結果表明,白果中 GAs 含量 GA(15:1)461.86μg/g～922.35μg/g,GA(17:2)86.68μg/g～227.75μg/g,GA(17:1)81.67μg/g～279.75μg/g;對白果中的MPN進行測定,結果表明MPN含量在256.38μg/g～373 μg/g。采用苦味酸試紙法對白果中氰化物進行分析,結果表明,白果中氰化物含量低于檢測限,呈陰性反應。結論,氰化物不是引起白果急性中毒的毒性物質,且不同批次間,GAs及MPN含量差距較大。所建方法可靠易行,適用于白果毒性成分的評價分析。(二)基于體內過程的白果毒性物質作用特征及復合毒性研究1.銀杏酸類物質毒性表征及體內過程研究采用斑馬魚毒性實驗及小鼠LD50急性毒性實驗對GAs進行急性毒性評價,判斷毒性劑量,描述中毒癥狀。結果顯示:GAs致斑馬魚中毒呈給藥時間和濃度依賴性,毒性反應較慢,無急性毒性癥狀;小鼠口服GAs后,并未出現(xiàn)急性中毒癥狀,死亡集中發(fā)生于給藥后3～4天,LD50為7.89g/kg,95%的置信區(qū)間為(7.19～8.68)g/kg,處于低毒級別。開展了大鼠口服GAs的藥動學、組織分布及代謝組學等研究;GAs及其代謝物藥動學參數(shù)大鼠灌胃給藥后,高(900 mg/kg)、中(300 mg/kg)、低(100 mg/kg)三個劑量組C-T曲線均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象;GAs代謝物的藥動學研究中,選擇了定性可靠且峰面積可有效測定的6個代謝物。繪制相對變化曲線進行藥動學研究。6個代謝物為GA(15:1)和GA(17:1)的羥基化產(chǎn)物、羰基化同時羥基化產(chǎn)物(雙重氧化產(chǎn)物)以及葡萄糖醛酸化產(chǎn)物,高劑量給藥組的代謝物生成量明顯少于中、低劑量組,各代謝物的達峰所需時間,較原型化合物均存在滯后現(xiàn)象。GAs組織分布大鼠口服GAs后,迅速分布于主要臟器中,且主要蓄積于肝臟。0.5 h時肝臟中分布最多,隨后逐漸減少。腦中含量逐漸升高至4 h時含量最多,隨后逐漸下降。5種GAs的組織分布情況大致相同。GAs排泄大鼠以900 mg/kg的劑量灌胃給藥GAs后,主要從糞便排出體外,糞便排泄率為29.6%,尿液排泄率為0.004%,膽汁排泄率為3.54%。5個GAs在各排泄物中的排泄趨勢一致,尿液的排泄主要集中在6～12 h,糞便的排泄主要集中在12～48 h,24 h內膽汁的排泄比較均勻。各個化合物在排泄物中的排泄比例與給藥GAs中的比例類似,各個銀杏酸大鼠排泄過程沒有顯著差異�？诜礼As血清代謝組學大鼠口服GAs之后,血清中BUN和CRE顯著增高,TP和ALB顯著降低,提示GAs對肝腎功能存在一定的損傷。血清中相關的酶ALT、AST、LDH以及CK的活力顯著降低,可能與GAs對體內酶活的抑制作用有關。主成分分析(PCA)圖中,不同分組的樣品之間具有顯著差異,口服GAs后第3天的樣本距離空白組樣本最遠,提示第3天時大鼠體內的內源性成分產(chǎn)生了顯著的變化,在第7天時機體內源性物質逐漸回歸正常水平,提示機體存在自我恢復的能力。這一結果與小鼠口服銀杏酸的LD50實驗結果相符;初步定性的14個關鍵生物潛在標志物,主要包括不同類型的LysoPC和LysoPE。這些生物標志物主要集中在鞘脂類代謝、甘油磷脂代謝及原發(fā)性膽汁酸的生物合成通路中,提示GAs毒性可能作用于這些代謝通路而引起毒性反應。2.吡哆醇類物質毒性表征及體內過程研究采用斑馬魚毒性實驗及小鼠LD50急性毒性實驗對MPN進行急性毒性評價,判斷毒性劑量,描述中毒癥狀。結果顯示,MPN可對斑馬魚幼魚有神經(jīng)毒性的影響,且對斑馬魚臟器形態(tài),胚胎孵化具有一定影響;小鼠口服MPN出現(xiàn)抽搐驚厥等急性毒性癥狀。中毒劑量與死亡劑量相近,LD50為35.20 mg/kg,95%的置信區(qū)間為(33.18～37.33)mg/kg。MPN中毒后的毒性表現(xiàn)與白果中毒癥狀相符,提示MPN是引起白果急性中毒的主要毒性物質。開展了 MPN及其相關吡哆醇類化合物的藥動學、組織分布、代謝組學研究;MPN藥動學參數(shù)大鼠口服MPN后,血漿中的吡哆酸(4-PA)、吡哆醇(PN)與吡哆醛(PL)的血藥濃度均有上升,這一結果說明4-PA、PL和PL可能是MPN 口服后的代謝產(chǎn)物。另一方面,也可能是由于MPN較維生素B6更易與磷酸激酶PKH反應,以此抑制了 PL的磷酸化,從而導致體內PL含量的升高。而4-PA是PL的氧化產(chǎn)物,并作為維生素B6的末端代謝產(chǎn)物最終由腎臟排出。MPN作為維生素B6的衍生化合物,可能也存在這一代謝過程。MPN組織分布大鼠口服MPN后,在組織中迅速分布,5 min即達到最大分布量,之后逐漸減少。各主要臟器中均有分布,肝臟中的分布蓄積量較大。24 h時各組織樣品中MPN含量已降至較低水平。4-PA在心、肝、脾、肺、腎中均有一定分布,在腦組織中未能檢測到。各時間點組織樣品中,肝臟與腎臟中4-PA含量較高,心臟樣品中可測的4-PA含量較低,15 min之內肺與脾臟樣品中4-PA含量較低,4-PA大部分分布于肝、腎組織中,0.5 h～1 h之間肺與脾臟中的4-PA含量升高,4h時大幅度降低。24 h時各組織樣品中均能檢測到4-PA,且大部分分布于肝臟與腎臟之中。這可能與其在肝臟內被代謝并最終經(jīng)腎臟排泄有關。MPN-5'-glucoside藥動學研究大鼠口服 MPN-5'-glucoside 后,血漿中 MPN-5'-glucoside含量迅速升高,并在4 h之內快速下降,血漿中迅速代謝生成MPN,并在4 h之內快速下降至難以測得。血漿中4-PA、PL以及PN濃度均同步升高,代謝趨勢相似。提示,MPN-5'-glucoside進入體內后代謝生成MPN,進一步引起4-PA、PL以及PN的變化�？诜﨧PN代謝組學研究大鼠口服MPN后,24 h之內進行血清代謝組學研究,所測13個生化指標,結果表明,口服MPN后血清中的TBIL、LDH、BUN、CRE、BUN和CRE水平均有顯著變化。5 min之后血清中BUN和CRE水平相比空白組,產(chǎn)生了明顯的下降,24 h時仍與空白組存在顯著差異。TBIL水平顯著下降,LDH的活力在給藥后顯著增高,隨后在整個實驗過程中逐漸下降,至24 h時恢復至與空白組相近的水平。3.白果主要毒性物質復合毒性表征GAs對MPN大鼠藥動學的影響大鼠同時給予GAs與MPN后,MPN的AUC(0-t)顯著降低,血漿中4-PA的AUC(0-t)與MPN的AUC(0-t)存在相似比例的下降,PN的AUC(0-t)存在小幅度上升現(xiàn)象,而PL的AUC(0-t)與單獨給予MPN時相近,顯示GAs對MPN的體內過程存在顯著影響。同時給予GAs后,MPN、4-PA、PN以及PL的Tmax與單獨口服MPN相比均存在延遲現(xiàn)象,這可能與GAs對MPN的吸收或對體內酶活存在抑制作用有關,從而延遲了 MPN及其代謝物的達峰時間,并降低MPN的Cmax。MPN對GAs大鼠藥動學參數(shù)的影響單獨給予GAs時,藥時曲線存在雙峰現(xiàn)象;大鼠同時給予GAs與MPN后,GAs并無明顯的雙峰現(xiàn)象,GA(13:0)的AUC(0-t)較單獨給予GAs時增大,其余四種GAs的AUC(0-t)均有小幅度的減小。GA(13:0)與 GA(15:1)的 Cmax增大,而 GA(17:2)、GA(15:0)與GA(17:1)的Cmax均少許降低;血漿中的GAs代謝物含量發(fā)生了明顯的變化,其中羥基化產(chǎn)物明顯降低,而葡萄糖醛酸化產(chǎn)物含量升高。MPN與GAs合并口服后,對GAs的體內過程存在影響。此影響可能與銀杏酸的脂肪鏈長度存在一定關系。吡哆醇類化合物復合毒性研究同時給予MPN后,并未顯著影響MPN-5,-glucoside的藥動學參數(shù),但血漿中4-PA、PL與PN上升幅度均比單獨口服MPN-5'-glucoside時更大。MPN-5'-glucoside 口服后在體內代謝生成MPN,進一步生成4-PA、PL與PN等代謝產(chǎn)物。(三)白果減毒方法優(yōu)化及機制研究在可食部位中,胚芽是含毒性成分最高的部位,其重量占可食部位總重量的2.82%,但含有的GAs卻占可食部位中GAs的62.1%,含有的MPN占3.87%。提示,去除白果中的胚芽,可有效地降低白果可食用部位的毒性。加工溫度與干燥速度是影響白果中毒性物質含量的主要影響因素。50℃以下加工,白果中GAs與MPN含量變化較小。50℃及更高溫度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃),同時保持白果濕度條件下,白果中MPN損失率達90%以上,但高溫快速干燥過程中,白果中MPN含量幾乎不變。GAs在高溫(90℃、100℃)處理后的白果中含量減少約55%。結果提示,MPN的含量變化可能與自身含有酶的轉化有關,溫度過低酶活力不夠,快速干燥過程中白果中水分迅速流失,在水分少的條件下酶活力下降,MPN的減少亦非常有限。比較白果樣品處理前后的色譜圖,保濕保溫60℃放置12h后,白果樣品中的MPN峰顯著降低至難以辨認,同時色譜圖中另外三個峰明顯增高。溫度越高白果中MPN轉化速率越快,且存在平衡點。三個轉化產(chǎn)物在加熱開始時,隨加工的時間增加而增加,溫度越高轉化產(chǎn)物增長越多,速率越快。提示白果中各成分在加熱過程中存在一定的平衡狀態(tài),最終達到穩(wěn)定的狀態(tài)。經(jīng)過對照品比對,其中一個轉化產(chǎn)物確定為4'-O-甲基吡哆醇-5'-葡萄糖(MPN-5'-glucoside)。推測這是MPN在白果自身含有的葡萄糖苷酶作用下的生物轉化產(chǎn)物。采用模式生物斑馬魚比較MPN與MPN-5'-glucoside的毒性,結果顯示MPN-5'-glucoside的毒性明顯小于MPN。在以上研究的基礎上,制定了基于酶促方法解除白果毒性的方法,并進行了工藝驗證。確定的工藝為:新鮮白果采用控溫控濕設備或在控濕條件下以其它加熱設備控制溫度60℃條件下,使其含水量保持50%以上,維持7小時,之后加熱至90℃～100℃,進行加熱干燥至需要的含量,并再繼續(xù)保持溫度1小時。生產(chǎn)的低毒白果可作為各類白果產(chǎn)品開發(fā)的原料。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.1
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本文編號：2308523